Inflammation sévère à l'état neuf | Revêtements de sol de Pékin Co., Ltd

BMC Medicine volume 20, Numéro d'article : 235 (2022) Citer cet article

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La septicémie néonatale peut induire des troubles cognitifs à long terme à l'adolescence ou à l'âge adulte, mais le mécanisme moléculaire sous-jacent n'est pas entièrement compris. L'expression du co-transporteur K+-Cl– 2 (KCC2) joue un rôle central dans le passage GABAergique de la dépolarisation à l'hyperpolarisation au cours du développement postnatal précoce. Dans cette étude, nous avons cherché à déterminer si la déficience cognitive néonatale induite par une inflammation sévère était associée à l'expression de KCC2 au cours du développement précoce.

Une inflammation néonatale sévère a été établie par injection intrapéritonéale de lipopolysaccharide à haute dose (LPS, 1 mg kg–1) chez des rats au troisième jour postnatal (P3). La tâche du labyrinthe aquatique de Morris et le test de conditionnement de la peur ont été utilisés pour étudier les fonctions cognitives à long terme. ELISA, RT-PCR et Western blot ont été utilisés pour examiner les niveaux d'expression des cytokines pro-inflammatoires et de KCC2. Des enregistrements de patch-clamp perforés ont été utilisés pour déterminer le décalage GABAergique.

Une inflammation sévère néonatale a entraîné une déficience cognitive à long terme chez les rats. Pendant ce temps, une élévation soutenue des niveaux d'interleukine-1 bêta (IL-1β) a été constatée dans l'hippocampe jusqu'à P30 après l'injection de LPS. Une expression élevée de KCC2 et un potentiel d'inversion GABA hyperpolarisé (EGABA) ont été observés dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe CA1 des rats P7-P10 et P14-P16 après injection de LPS. L'inactivation spécifique de l'expression de l'ARNm de l'IL-1β a sauvé l'expression élevée de KCC2 et de l'EGABA hyperpolarisé à P7-P10 et P14-P16. En conséquence, l'inactivation spécifique de l'expression d'IL-1β ou de KCC2 a amélioré la déficience cognitive induite par une inflammation néonatale sévère.

Une élévation soutenue de l'IL-1β dans l'hippocampe peut induire une déficience cognitive par régulation positive de KCC2 au cours du développement précoce.

Rapports d'examen par les pairs

Le sepsis est un syndrome potentiellement mortel résultant d'une réponse dérégulée de l'hôte aux infections [1], en particulier chez les nouveau-nés. La septicémie néonatale est généralement causée par une invasion bactérienne dans la circulation sanguine au cours du premier mois de vie [2], qui est une cause majeure de mortalité dans les unités de soins intensifs néonatals [3, 4]. L'Organisation mondiale de la santé estime que la septicémie néonatale cause un million de décès par an dans le monde, et 42 % de ces décès surviennent dans la première semaine après la naissance [5]. Ces dernières années, le taux de survie de la septicémie néonatale s'est nettement amélioré avec les progrès médicaux. Malheureusement, les survivants du sepsis néonatal ont un risque accru de troubles cognitifs à long terme [6,7,8]. Cependant, le mécanisme moléculaire par lequel la septicémie néonatale induit une déficience cognitive à long terme reste incertain.

Au cours de la septicémie, les niveaux d'expression des cytokines pro-inflammatoires, telles que le TNF, l'IL-6 et l'IL-1β, sont augmentés dans le système nerveux central (SNC), qui jouerait un rôle central dans les troubles cognitifs à long terme après une septicémie. 9, 10]. L'injection systémique de lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine bactérienne, est couramment utilisée pour induire une inflammation chez les animaux nouveau-nés afin de reproduire les multiples complications, telles que les troubles cognitifs, qui sont également observées chez les nouveau-nés humains après une septicémie [11,12,13, 14]. L'injection de LPS peut induire une augmentation des cytokines pro-inflammatoires, dont le TNF, l'IL-6 et l'IL-1β [15]. En particulier, l'IL-1β joue un rôle central dans la neuroinflammation soutenue après une septicémie et est étroitement impliquée dans le traitement de la mémoire et la potentialisation à long terme, ainsi que dans les troubles cognitifs induits par la septicémie néonatale [10, 16, 17]. Cependant, la façon dont l'IL-1β intervient dans les troubles cognitifs induits par la septicémie néonatale, en particulier pendant la période de développement du SNC, reste incertaine.

L'acide γ-aminobutyrique (GABA) est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC. Fait intéressant, le GABA intervient dans les effets dépolarisants au stade précoce du développement de diverses parties du SNC des vertébrés en raison d'une concentration intracellulaire élevée de chlorure maintenue par un importateur, Na+-K+-2Cl– co-transporteur 1 (NKCC1) [18]. Les actions dépolarisantes du GABA jouent un rôle important impliquant la prolifération et la survie cellulaire, la migration, la différenciation et le câblage précoce du réseau [18]. Ces dernières années, de nouvelles preuves ont mis en lumière le rôle de la signalisation dépolarisante du GABA in vivo [18, 19], qui peut dépendre de la région. Par exemple, les effets dépolarisants de la transmission GABAergique médient la modulation excitatrice dans l'hippocampe de la souris [19], alors qu'elle provoque des effets inhibiteurs [18,19,20] dans le néocortex de la souris au début du développement postnatal. Au cours du développement postnatal, un passage des effets dépolarisants aux effets hyperpolarisants de l'activation GABAergique a été induit par une meilleure extrusion de chlorure médiée par la régulation à la hausse du co-transporteur K + -Cl– 2 (KCC2) [21, 22, 23, 24]. Ce changement GABAergique développemental peut servir d'indicateur du stade de maturation de populations neuronales distinctes [25] et est associé au développement synaptique et à la plasticité neuronale [26]. En plus de définir la polarité de la fonction GABAergique pendant la maturation neuronale, KCC2 a des fonctions profondes indépendantes du transport d'ions, telles que la modulation de l'apoptose développementale et les activités précoces du réseau, et est impliquée dans plusieurs maladies [18, 27,28,29].

Bien que des études antérieures aient montré que l'IL-1β peut réguler l'expression de KCC2 dans le SNC [27, 30], on ne sait pas si un changement GABAergique anormal induit par une expression altérée de KCC2 est impliqué dans la septicémie néonatale ou une inflammation sévère induite à long terme. déficience cognitive. Ici, nous avons émis l'hypothèse qu'une élévation soutenue des niveaux d'IL-1β affectait le changement GABAergique en modulant l'expression de KCC2 dans les neurones pyramidaux de l'hippocampe CA1 au cours de la période de développement, ce qui a finalement contribué à une déficience cognitive à long terme après une inflammation néonatale sévère.

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d'éthique animale de l'hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan (Chengdu, Sichuan, Chine) et a été mené conformément aux directives de la recherche animale : rapports d'expériences in vivo (ARRIVE). Des rats Sprague – Dawley au 16e jour de gestation ont été achetés (Chengdu Dossy Experimental Animals CO., LTD.) et ont été séparés et surveillés jusqu'au jour de la naissance de la progéniture. Les descendants postnatals (les deux sexes) ont été gardés avec leurs mères avec de la nourriture et de l'eau disponibles ad libitum. Les animaux ont été maintenus sous un cycle lumière/obscurité de 12 h (7 h 00 à 19 h 00) à une humidité (45 %-55 %) et une température (22–24 °C) constantes. Après sevrage à P21, les animaux ont été logés par groupes de cinq rats par cage.

Le LPS (Sigma, USA) a été dissous dans une solution saline normale et injecté par voie intrapéritonéale avec une dose de 1 mg kg-1 à P3. IL-1β-siRNA (séquence sens : 5'-GCACAGACCUGUCUUCCUATT-3' ; séquence antisens : 5'-UAGGAAGACAGGUCUGUGCTT-3'), avec la modification de 5'-FAM, KCC2-siRNA (séquence sens : 5'-GCCAUUUCCAUGAGCGCAATT- 3' ; séquence antisens : 5'-UUGCGCUCAUGGAAAUGGCTT-3') avec la modification de 5'-CY5, et contrôle négatif (contrôle-ARNsi, séquence sens : 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3' ; séquence antisens : 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3') (GenePharma, Shanghai, Chine) ont été dissous dans de l'eau sans RNase. L'IL-1β-siARN, le KCC2-siARN ou le contrôle négatif ont été mélangés avec le réactif de transfection In vivo SilenceMag™ (OZ Biosciences, Marseille, France) à une concentration finale de 1 μg μL-1 20 min avant l'injection. Ensuite, IL-1β-siARN, KCC2-siARN ou contrôle négatif a été injecté dans les régions CA1 bilatérales de l'hippocampe (0,5 μL de chaque côté) à P2 et/ou P7.

Les rats ont été placés sur de la glace pour induire une anesthésie par hypothermie comme décrit dans une étude précédente [31] et montés dans un appareil stéréotaxique (RWD, Shenzhen, Chine). Une pommade ophtalmique a été appliquée sur les yeux de rats P7. IL-1β-siARN/KCC2-siARN/contrôle-siARN (0,5 μL) a été injecté bilatéralement dans les régions CA1 de l'hippocampe (point médian entre le bregma et la suture sagittale, latéral : ± 1,5 mm, profondeur : 1,2–1,4 mm pour P2 et 1,6 –1,8 mm pour P7) à un débit de 100 nL min−1. Une fois l'injection terminée, la pipette en verre a été laissée en place pendant 5 min et retirée lentement pour éviter le reflux. Ensuite, les animaux ont été autorisés à récupérer sur une couverture chauffante avant de retourner dans leurs cages d'origine.

Pour minimiser les effets de la portée, les descendants postnatals des deux sexes de chaque portée ont été répartis au hasard dans les groupes expérimentaux. Les petits ont ensuite été remis à leur mère et sevrés jusqu'à P21. Après P21, les rats ont été regroupés dans chaque groupe expérimental et logés au hasard 5 rats par cage (du même sexe). Par conséquent, les rats de chaque cage provenaient de portées différentiellement aléatoires. Toutes les affectations d'animaux ont été faites pour assurer la distribution à peu près égale du sexe et du traitement de chaque portée. Aucun ensemble différent de portées n'a été utilisé pour les diverses cohortes d'expériences. Le modèle d'inflammation sévère néonatale a été induit par injection intrapéritonéale d'une forte dose de LPS (1 mg kg-1) chez des rats P3. Dans le groupe témoin, les rats ont reçu une injection intrapéritonéale de solution saline normale (NS) seule. Dans le groupe LPS, les rats ont reçu une injection intrapéritonéale de LPS seul. Dans le groupe NS + contrôle-siARN, les rats ont reçu une injection CA1 hippocampique de contrôle-siARN et une injection intrapéritonéale de solution saline normale. Dans le groupe LPS + contrôle-siARN, les rats ont reçu une injection CA1 hippocampique de contrôle-siARN et une injection intrapéritonéale de LPS. Dans le groupe LPS + IL-1β-siARN, les rats ont reçu une injection CA1 hippocampique d'IL-1β-siARN et une injection intrapéritonéale de LPS. Dans le groupe LPS + KCC2-siARN, les rats ont reçu une injection CA1 hippocampique de KCC2-siARN et une injection intrapéritonéale de LPS.

L'apprentissage spatial et la mémoire des rats adolescents ont été évalués par le test du labyrinthe aquatique de Morris comme décrit précédemment [32]. En bref, le système consistait en une piscine ronde (90 cm de diamètre, 50 cm de profondeur) divisée en quatre quadrants. Des objets de formes différentes ont été attachés au mur de chaque quadrant pour servir d'indices visuels spatiaux. La température de l'eau a été maintenue à 30 ± 1 °C. Une plate-forme circulaire d'un diamètre de 10 cm a été placée à 1 cm sous la surface de l'eau noire et à 30 cm de la paroi de la piscine. Le quadrant contenant la plate-forme a été défini comme le quadrant cible. Les traces de nage des rats ont été enregistrées par une caméra vidéo automatique. Avant le test de navigation d'orientation, chaque rat a été entraîné trois fois par jour pendant 4 jours consécutifs. Le rat a été placé dans l'eau face à la paroi de la piscine. Si le rat a trouvé la plate-forme dans les 90 s et est resté sur la plate-forme pendant 15 s, la période de temps a été définie comme la latence d'échappement. Sinon, le rat a été guidé vers la plate-forme pour rester pendant 15 s, et la latence d'échappement a été enregistrée à 90 s. Pendant le test, la plate-forme a été retirée et le rat a été autorisé à nager pendant 90 s. Le nombre de traversées dans la zone cible, le temps passé et la distance totale parcourue dans le quadrant cible ainsi que la vitesse moyenne ont été enregistrés. Le logiciel SMART (Panlab, Barcelone, Espagne) a été utilisé pour analyser la trace de nage de chaque rat.

Deux jours après le labyrinthe aquatique de Morris, les mêmes rats ont été soumis au test de conditionnement de la peur selon le paradigme décrit précédemment avec des modifications mineures [33]. Les rats ont été entraînés à connecter le contexte (chambre) à un stimulus aversif (choc du pied ; stimulus inconditionné, États-Unis), qui peut être utilisé pour évaluer le conditionnement contextuel de la peur dépendant de l'hippocampe. Le choc du pied a également été associé à un signal sonore (stimulus conditionné, CS) pour évaluer le conditionnement de la peur indicé indépendant de l'hippocampe. La peur conditionnée s'est manifestée comme un comportement de congélation en cessant tout mouvement à l'exception de la respiration lorsque les rats ont été réexposés au contexte ou au ton. Les paramètres d'entraînement étaient les suivants : tonalité, 30 s, 80 dB, 2 kHz ; choc, 2 s, 0,8 mA. Le jour 1, chaque rat a été placé dans une chambre de conditionnement de la peur et autorisé à explorer librement pendant 2 min. Ensuite, une tonalité a été délivrée suivie d'un choc au pied. Deux minutes plus tard, une deuxième paire CS-US a été livrée. Au jour 2, chaque rat a été réexposé à la même chambre de conditionnement de la peur mais sans délivrance d'un CS ou d'un choc au pied. La congélation a été enregistrée pendant 3 min. Une heure plus tard, chaque rat a été placé dans un nouveau contexte contenant une odeur, une solution de nettoyage, une texture de sol et une paroi de chambre différentes. Les rats ont été autorisés à explorer pendant 2 min avant d'être réexposés au ton. La congélation a été évaluée pendant 3 minutes, puis mesurée à l'aide du système et du logiciel de suivi vidéo ANY-maze (Stoelting, Wood Dale, IL).

Les rats ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique (100 mg kg-1) et perfusés par voie transcardiaque avec une solution de Ringer glacée. L'hippocampe a été rapidement retiré et homogénéisé avec un tampon de lyse glacé (Beyotime, Chine) contenant des inhibiteurs de phosphatase et de protéase. La concentration en protéines a été déterminée par un kit d'analyse de protéines BCA (Beyotime, Chine). Vingt microgrammes d'échantillons de protéines ont été séparés par un gel NuPAGETM4-12% Bis – Tris (Thermo Fisher Scientific) et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Thermo Fisher Scientific) à l'aide du système iBLOT2. La membrane a été bloquée dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20 et 5 % de lait écrémé pendant 2 h, puis incubée avec des anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit, y compris des anti-IL-1β de lapin (1 : 2000, Abcam ), lapin anti-KCC2 (1:1000, Sigma-Aldrich) et lapin anti-β-actine (1:1000, Proteintech). Ensuite, les membranes ont été incubées avec un anti-lapin conjugué à la peroxydase de raifort (1: 5000, Proteintech, Chine) pendant 1 h à température ambiante et scannées avec des réactifs de chimiluminescence (ECL; Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) en utilisant le système Chemidoc XRS. (Bio-Rad). La densité des bandes a été analysée par le logiciel ImageJ. La densité des bandes du groupe témoin a été fixée à 100 %. Les valeurs de densité relative des autres groupes ont été déterminées en divisant les valeurs de densité de ces groupes par les valeurs témoins après que chacune a été normalisée à la β-actine. Les images originales des résultats du Western blot ont été présentées dans le fichier supplémentaire 1.

L'ARN total de l'hippocampe a été isolé à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN Eastep® Super (Promega, Shanghai, Chine) suivi d'une transcription inverse avec un kit de transcription inverse GoScript™ (Promega, Shanghai, Chine) selon le protocole du fabricant. Enfin, la RT-PCR a été réalisée avec GoTaq® qPCR Master Mix (Promega, Shanghai, Chine) et des amorces spécifiques (Sangon Biotech, Shanghai, Chine). La variation relative de l'expression génique a été calculée avec la méthode 2−ΔΔCt avec GAPDH comme contrôle interne [34]. Les amorces utilisées pour détecter les ARNm de TNF, IL-6, IL-1β, KCC2 et GAPDH étaient les suivantes :

TNF avant : 5'-CTGTGAAGGGAATGGGTGTT-3';

TNF inverse : 5'-CAGGGAAGAATCTGGAAAGGTC-3';

IL-6 vers l'avant : 5'-GGCCCTTGCTTCTCTTCG-3' ;

IL-6 inverse : 5'-ATAATAAAGTTTTGATTATGT-3';

IL-1β vers l'avant : 5'-AGTTGACGGACCCAAAAG-3' ;

IL-1β inverse : 5'-AGCTGGATGCCTCTCATCAGG-3' ;

KCC2 vers l'avant : 5'-AGGTGGAAGTCGTGGAGATG-3' ;

KCC2 inverse : 5'-CGAGTGTTGGCTGGATTTCT-3';

GAPDH vers l'avant : 5'-GACATGCCGCCTGGAGAAAC-3' ;

GAPDH inverse : 5'-AGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'.

Des expériences ELISA ont été réalisées pour quantifier les niveaux de cytokines pro-inflammatoires, notamment le TNF, l'IL-1β et l'IL-6, dans le sérum sanguin. En bref, les rats ont été anesthésiés avec ~ 3 % de sévoflurane. Des échantillons de sang (200 à 500 μL) ont été prélevés directement du cœur, conservés dans des tubes EDTA et incubés pendant au moins 30 min à température ambiante. Ensuite, les échantillons ont été centrifugés à 2000 g pendant 20 min à température ambiante pour séparer le sérum des composants sanguins cellulaires. Les surnageants ont été immédiatement extraits et congelés dans de l'azote liquide. Des kits ELISA (Neobioscience) ont été utilisés pour déterminer les niveaux de cytokines selon les instructions du fabricant. L'absorbance à 450 nm a été mesurée avec un lecteur de microplaques Tecan Sunrise™ avec une correction de longueur d'onde à 680 nm connecté au logiciel Magellan. La concentration en protéines des échantillons a été déterminée par la densité optique mesurée de la réaction en fonction de la densité optique des échantillons standards connus.

Des rats à P7-P10, P14-P16 ou P28-P32 des deux sexes ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique (100 mg kg-1). Le cerveau a été rapidement disséqué, et des coupes transversales d'hippocampe dorsal (300 μm d'épaisseur) ont été obtenues dans du liquide céphalo-rachidien artificiel glacé à base de saccharose contenant (en mM) : 260 saccharose, 26 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO4, 1 CaCl2, 5 MgCl2 et 10 glucose à l'aide d'un vibratome (VT1000 A; Leica). Les tranches ont été immédiatement transférées et incubées à 35 °C avec du liquide céphalo-rachidien artificiel contenant (en mM) : 130 NaCl, 3 KCl, 2 MgCl2, 2 CaCl2, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3 et 10 glucose pendant 45 min, puis conservées à température ambiante. température (24–26 °C) pendant 30 min avant l'enregistrement. La solution de tranchage et d'incubation a été barbotée en continu avec 95 % d'O2/5 % de CO2, avec un pH de 7,35.

Des tranches d'hippocampe ont été montées dans une chambre d'enregistrement et perfusées avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF) à un débit de 2 ~ 3 ml min-1 et barbotées avec 95 % d'O2 et 5 % de CO2, pH = 7,35. Les cellules pyramidales CA1 ont été sondées séquentiellement en commençant près de la frontière CA2/CA1 et en procédant médialement à des emplacements bien séparés. Les neurones pyramidaux ont ensuite été identifiés sous contraste différentiel/illumination infrarouge par leur emplacement dans la couche du corps cellulaire et par leur forme pyramidale. Les enregistrements perforés ont été réalisés à l'aide de pipettes patch (6–8 MΩ) remplies de la solution interne contenant (en mM) 140 K-gluconate, 10 HEPES, 5 EGTA 1 MgCl2, 2 Na2-ATP, 0,3 Na2-GTP, pH ajusté à 7,2 avec KOH et osmolarité à ~ 285 mOsm. Les pipettes de patch ont été remplies au minimum avec la solution interne standard et ont ensuite été remplies avec une solution contenant de la gramicidine. La gramicidine (HY-P0163, MedChemExpress), dissoute dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration finale de 50 μg mL-1, a été utilisée comme agent porogène pour les enregistrements perforés. Les canaux de gramicidine sont sélectivement perméables aux cations monovalents et aux petites molécules neutres mais imperméables au chlorure, ce qui permet un accès électrique aux neurones enregistrés sans perturber leurs gradients anioniques. Dans les ~ 20 à 40 min après la formation du giga joint, la résistance d'accès a lentement chuté et s'est stabilisée à ~ 20 à 35 MΩ. Le potentiel de membrane au repos (RMP) a ensuite été enregistré comme la tension sans courant injecté. Pour estimer la concentration de chlorure, le potentiel d'inversion GABA (EGABA) a été évalué. Les neurones ont été maintenus à -60 mV et le potentiel de membrane a été échelonné à divers potentiels de test de -80 à -30 mV. Au cours de chaque étape de potentiel membranaire, du GABA (10 μM) en solution extracellulaire a été délivré par application de bain pour activer les courants en présence de cyanquixaline (CNQX, 10 μM) et d'acide DL-2-amino-5-phosphonopentanoïque (40 μM). Une régression linéaire entre l'amplitude des courants induits par le GABA et le potentiel de membrane a été calculée, et l'interception de cette ligne avec l'abscisse a été prise comme EGABA. Tous les enregistrements électrophysiologiques ont été réalisés à l'aide d'un amplificateur Axopatch 700B et d'un numériseur Digidata1440 relié à un ordinateur exécutant le logiciel pClamp 10.2 (Molecular Devices, Sunnyvale, USA). Les signaux ont été échantillonnés à 20 kHz et filtrés à 10 kHz. Les capacités des cellules et des électrodes ont été compensées électroniquement pendant l'enregistrement. La cellule était jetée si la résistance d'accès changeait de > 25 %.

Les données ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart type (SD) et des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 8.0 (GraphPad Software, CA, USA). La normalité de la distribution des données a été évaluée à l'aide du test de Shapiro-Wilk. Des tests t de Student appariés/non appariés ou des tests U de Mann–Whitney ont été utilisés pour comparer les données de distribution paramétrique ou les données de distribution non paramétrique entre deux groupes, respectivement. Les données de trois groupes ou plus ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle ou bidirectionnelle (ANOVA) avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Bonferroni ou de Tukey. L'analyse exacte utilisée pour chaque comparaison a été décrite dans les légendes des figures, et toutes les informations statistiques pour chaque résultat ont été résumées dans le fichier supplémentaire 2 : Tableau S1-S11. P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Un modèle d'inflammation néonatale a été induit chez des rats P3 (Fig. 1A). Comparé au groupe témoin, le gain de poids corporel des rats était plus lent au cours du développement dans le groupe LPS (Fig. 1B, n = 8, ** P <0, 01, *** P <0, 001 par rapport au groupe témoin). Aucun décès n'a été constaté chez les rats du groupe témoin, alors qu'une mortalité de 36,7 % a été observée dans le groupe LPS (Fig. 1C, ** P < 0,01). La formation à la tâche du labyrinthe aquatique de Morris (MWM) a été effectuée de P28 à P31. Au cours des 4 jours d'entraînement à l'acquisition, la latence d'échappement a diminué progressivement chez les rats des groupes témoin et LPS, ce qui suggère que les deux groupes ont montré un apprentissage spatial et une formation de mémoire dépendant de l'hippocampe (Fig. 1D). Cependant, la latence d'échappement chez les rats du groupe LPS était significativement augmentée par rapport aux rats témoins au jour 4 de l'entraînement, indiquant une altération potentielle de la formation de la mémoire (Fig. 1D, n = 15–19, P = 0, 029). Pendant le test de sonde spatiale (Fig. 1E), le temps passé (Fig. 1F, n = 15–19, *** P < 0,001) et la distance (Fig. 1G, n = 15–19, *** P < 0,001) dans le quadrant cible, ainsi que les temps de traversée de la plateforme (Fig. 1H, n = 15–19, *** P < 0,001), ont été diminués dans le groupe LPS par rapport au groupe témoin. Aucune différence significative n'a été trouvée dans la vitesse moyenne des rats entre les deux groupes (Fig. 1I, n = 15–19, P = 0, 065), ce qui suggère que la capacité locomotrice n'a pas été affectée par l'injection de LPS. Les mêmes rats ont ensuite été soumis à un test de conditionnement de la peur (FC) (Fig. 1J). Après l'entraînement à P34 (Fig. 1K), les rats du groupe LPS ont présenté une diminution de la congélation dans les tests contextuels dépendant de l'hippocampe par rapport à celui du groupe témoin (Fig. 1L, n = 15–19, *** P <0, 001), mais aucune différence n'a été observée pour le test de tonalité indépendante de l'hippocampe à P35 (Fig. 1M, n = 15–19, P = 0, 474).

Une inflammation sévère néonatale entraîne une déficience cognitive durable chez les rats adolescents. (A) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour l'établissement du modèle d'inflammation et des tests cognitifs. Cinq portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérience. (B) Le développement du poids corporel chez les rats (n = 8). (C) La courbe de survie des rats. (D) Courbe d'apprentissage pour la latence d'échappement. (E) Traces représentatives pour le test MWM. (F) Le temps passé dans le quadrant cible (n = 15–19). (G) Distance passée dans le quadrant cible (n = 15–19). (H) Nombre de traversées de plateformes (n = 15–19). (I) Vitesse moyenne pendant le test de sonde spatiale (n = 15–19). (J) Le protocole expérimental pour FC. (K) Le temps de congélation des rats pendant la formation FC. (L) Le temps de congélation des rats dans le cadre du test FC (n = 15–19). (M) Le temps de congélation des rats dans le test FC indicé (n = 15–19). LPS : lipopolysaccharide ; NS : solution saline normale ; MWM : labyrinthe d'eau de Morris ; FC : conditionnement de la peur ; Les panels B, D et K ont été comparés par ANOVA à deux facteurs avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Bonferroni ; Le panel C a été comparé par le test du log-rank ; Les panels F, G, H, I, L et M ont été comparés par le test t de Student bilatéral non apparié ; * P < 0,05, ** P < 0,01 et *** P < 0,001, ns : non significatif ; Les barres d'erreur indiquent SD

Il convient de noter qu'une analyse supplémentaire a été effectuée lors de l'examen par les pairs pour déterminer si la déficience cognitive induite par une inflammation sévère néonatale était dépendante du sexe. Aucune différence significative entre les sexes n'a été trouvée dans le test MWM, car les rats septiques mâles et femelles présentaient une diminution similaire du temps passé (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1A à gauche, n = 9, ** P < 0,01 pour le mâle ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. . S1A droite, n = 6–10, ** P < 0,01 pour femme) et la distance (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1B gauche, n = 9, ** P < 0,01 pour homme ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1B droite, n = 6–10, P = 0,046 pour la femme) dans le quadrant cible, ainsi que les temps de traversée de la plateforme (Fichier complémentaire 3 : Fig. S1C gauche, n = 9, *** P < 0,001 pour l'homme ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1C à droite, n = 6–10, *** P < 0,001 pour la femelle) par rapport aux rats témoins. De même, par rapport au groupe témoin, une diminution du gel dans les tests contextuels (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1D gauche, n = 9, *** P < 0,001 pour les hommes ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1D droite, n = 6–10 , *** P < 0,001 pour les femmes) et aucune différence dans les tests de tonalité (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1E à gauche, n = 9, P = 0,301 pour les hommes ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S1E à droite, n = 6 –10, P = 0,949 pour la femelle) ont été observés chez les rats des deux sexes ayant reçu du LPS. Ces résultats suggèrent que l'inflammation néonatale sévère peut induire des troubles cognitifs à long terme chez les deux sexes.

Les niveaux de cytokines pro-inflammatoires dans le sang périphérique ont été examinés par ELISA à différents moments après l'injection de LPS (Fig. 2A). Les résultats ont montré que TNF (Fig. 2B, n = 6, ** P < 0,01), IL-6 (Fig. 2D, n = 6, ** P < 0,01, *** P < 0,001) et IL-1β (Fig. 2F, n = 6, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001) dans le sérum sanguin périphérique ont augmenté de manière significative à 2 h, 4 h et 6 h après l'injection de LPS, mais tous sont revenus aux niveaux de contrôle à 24 h après l'injection de LPS (Fig. 2B, 2D, 2F, n = 6, P > 0,05). Ensuite, nous avons examiné les niveaux d'expression de ces cytokines pro-inflammatoires dans l'hippocampe par RT-PCR et Western blot. Par rapport aux rats témoins, les niveaux d'expression de l'ARNm du TNF (Fig. 2C, n = 6, ** P < 0,01) et de l'IL-6 (Fig. 2E, n = 6, ** P < 0,01) étaient nettement élevés chez l'hippocampe 6 h après l'injection de LPS, mais les deux sont revenus aux niveaux de contrôle à P5 (Fig. 2C, 2E, n = 6, P > 0,05). Notamment, les niveaux élevés d'ARNm d'IL-1β (Fig. 2G, n = 6, ** P < 0,01) et de protéines (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S2, n = 6, ** P < 0,01, *** P < 0,001) ont été maintenus au moins jusqu'à P30, suggérant que l'IL-1β était la cytokine pro-inflammatoire prédominante dans le SNC après une inflammation néonatale sévère.

L'inflammation néonatale sévère induit une élévation soutenue de l'IL-1β dans l'hippocampe du rat. (A) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour le test de cytokine pro-inflammatoire après inflammation néonatale. Quatorze portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérimentation. (B, D, F) Résultats ELISA montrant les taux de protéines de TNF (B), IL-6 (D) et IL-1β (F) dans le sérum sanguin périphérique à 2 h (n = 6), 4 h (n = 6), 6 h (n = 6) et 24 h (n = 6). (C, E, G) Résultats de PCR montrant les niveaux d'ARNm de TNF hippocampique (C) et IL-6 (E) à 6 h après l'injection de LPS (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6 ), et P14 (n = 6), et IL-1β après injection de LPS (G) à 6 h (n = 6), P5 (n = 6), P7 (n = 6), P14 (n = 6), et P30 (n = 6). LPS : lipopolysaccharide, NS : solution saline normale, les panneaux B, C, D, E, F et G ont été comparés par le test t de Student bilatéral non apparié ou le test U de Mann-Whitney ; ** P < 0,01 et *** P < 0,001, ns : non significatif ; Les barres d'erreur indiquent SD

Pour déterminer le rôle de l'augmentation soutenue des niveaux d'IL-1β dans les troubles cognitifs induits par l'inflammation néonatale, l'IL-1β-siARN a été injecté bilatéralement dans la région CA1 de l'hippocampe pour renverser l'expression de l'ARNm de l'IL-1β (Fig. 3A) . La fluorescence portée par l'IL-1β-siRNA a été détectée dans CA1 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S3A). Les niveaux d'ARNm d'IL-1β ont été significativement diminués par l'IL-1β-siARN deux jours après l'injection (Fig. 3B, n = 6, *** P <0, 001). Par rapport au groupe LPS + contrôle-siARN, la latence d'échappement chez les rats du NS + contrôle-siARN (Fig. 3C, *** P < 0,001) et LPS + IL-1β-siARN (Fig. 3C, ** P < 0,01) groupes a été significativement diminué au jour 4 de la formation MWM. Pour le test MWM, le traitement avec IL-1β-siRNA a significativement amélioré les troubles cognitifs induits par l'inflammation néonatale (Fig. 3D-3F, n = 15–24, * P = 0,012, ** P < 0,01, *** P < 0,001) . Aucune différence significative n'a été trouvée dans la vitesse moyenne des rats parmi les trois groupes (Fig. 3G, n = 15–24, P = 0, 611). Pour FC, après l'entraînement (Fig. 3H), les rats du groupe LPS + IL-1β-siARN ont présenté une congélation accrue dans les tests contextuels dépendant de l'hippocampe par rapport à ceux du groupe LPS + contrôle-siARN (Fig. 3I, n = 15 –24, ** P < 0,01, *** P < 0,001). Aucune différence n'a été observée pour les tests de tonalité indépendante de l'hippocampe entre ces trois groupes (Fig. 3J, n = 15–24, P = 0, 786). Ces résultats indiquent que des niveaux élevés et soutenus d'IL-1β contribuent à une déficience cognitive à long terme après une inflammation néonatale.

Une élévation soutenue des taux d'IL-1β dans l'hippocampe contribue à une déficience cognitive à long terme après une inflammation néonatale sévère. (A) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour la livraison de siARN, l'administration de LPS et les tests cognitifs. Huit portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérience. (B) Résultats de la PCR montrant l'efficacité de knockdown de l'IL-1β-siRNA (n = 6). (C) Courbe d'apprentissage de la latence d'échappement. (D) Temps passé dans le quadrant cible (n = 15–24). (E) Distance passée dans le quadrant cible (n = 15–24). (F) Nombre de traversées de quai (n = 15–24). (G) Vitesse moyenne pendant le test de sonde spatiale (n = 15–24). (H) Le temps de congélation des rats en formation FC. (I) Le temps de congélation des rats dans le cadre du test FC (n = 15–24). (J) Le temps de congélation des rats dans le test FC indicé (n = 15–24). LPS : lipopolysaccharide ; NS : solution saline normale ; MWM : labyrinthe d'eau de Morris ; FC : conditionnement de la peur ; Le panneau B a été comparé par le test t de Student bilatéral non apparié ; Les panels C et H ont été comparés par ANOVA à deux voies avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Bonferroni ; Les panels D, E, F, G, I et J ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Tukey ; ** P < 0,01 et *** P < 0,001, ns : non significatif ; Les barres d'erreur indiquent SD

Premièrement, nous avons déterminé si l'expression de KCC2 était spécifique au sexe au cours du développement chez le rat. Les niveaux d'expression de KCC2 ont progressivement augmenté dans l'hippocampe de P3 à P14. Les niveaux d'expression de KCC2 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S4A, n = 6, P > 0,05 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S4B, n = 4, P > 0,05) n'ont montré aucune différence de sexe de P3 à P14. Ensuite, nous avons constaté que l'injection de LPS à P3 induisait une expression accrue de KCC2 à P7 (Fig. 4B panneau de gauche, n = 6, *** P < 0,001) et P14 (Fig. 4B panneau du milieu, n = 6, ** * P < 0,001) par rapport au témoin normal. Aucune différence n'a été trouvée dans l'expression de KCC2 (Fig. 4B panneau de droite, n = 6, P > 0, 05) chez les rats à P30 entre le groupe LPS et le groupe témoin. Ces résultats indiquent que l'inflammation néonatale peut accélérer le niveau d'expression accru de KCC2 au cours du développement précoce.

KCC2 médie les effets de l'IL-1β sur les troubles cognitifs induits par une inflammation sévère néonatale. (A) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour l'établissement du modèle d'inflammation et des tests de niveau KCC2. Cinq portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérience. (B) Les niveaux de protéines de KCC2 chez les rats P7 (panneau de gauche, n = 6), P14 (panneau du milieu, n = 6) et P30 (panneau de droite, n = 6) après injection de LPS. (C) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour l'injection d'ARNsi, l'établissement du modèle d'inflammation et les tests cognitifs. Neuf portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérience. (D) L'efficacité de knockdown de KCC2-siARN par PCR (n = 6). (E) Courbe d'apprentissage pour la latence d'échappement. (F) Temps passé dans le quadrant cible (n = 10–15). (G) Distance passée dans le quadrant cible (n = 10–15). (H) Nombre de traversées de plateformes (n = 10–15). (I) Vitesse moyenne pendant le test de sonde spatiale (n = 10–15). (J) Le temps de congélation des rats pendant la formation FC. (K) Le temps de congélation des rats dans le cadre du test FC (n = 10–15). (L) Le temps de congélation des rats dans le test FC indicé (n = 10–15). LPS : lipopolysaccharide ; NS : solution saline normale ; MWM : labyrinthe d'eau de Morris ; FC : conditionnement de la peur ; Les panels B et D ont été comparés par le test t de Student bilatéral non apparié ; Les panels F, G, H, I, K et L ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Tukey ; * P < 0,05, ** P < 0,01 et *** P < 0,001, ns : non significatif ; Les barres d'erreur indiquent SD

KCC2-siARN a été utilisé pour diminuer l'expression de KCC2 dans CA1 de l'hippocampe. La fluorescence portée par KCC2-siRNA a été détectée dans CA1 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S3B). L'efficacité de knockdown de KCC2-siRNA a été confirmée par RT-PCR (Fig. 4D, n = 6, *** P <0, 001). L'injection d'IL-1β-siRNA a diminué l'expression de l'IL-1β dans l'hippocampe à P7 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5A panneau de gauche, n = 6–8, *** P < 0,001 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S6 à gauche panneau, n = 6, *** P < 0,001), P14 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5A panneau du milieu, n = 6, ** P < 0,01 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S6 panneau du milieu, n = 6, ** P < 0,01) et P30 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5A panneau droit, n = 6, * P = 0,037 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S6 panneau droit, n = 6, * P = 0,013) après injection de LPS au P3. L'injection de KCC2-siRNA a diminué l'expression de KCC2 dans l'hippocampe à P7 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5B panneau de gauche, n = 6, * P = 0,025 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S7 panneau de gauche, n = 6, * P = 0,024) et P14 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5B panneau central, n = 6, ** P < 0,01 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. S7 panneau central, n = 6, * P = 0,014) après injection de LPS à P3 . De plus, l'inactivation de l'expression de l'IL-1β a inhibé l'augmentation de l'expression de KCC2 (Fichier supplémentaire 3 : Fig. S5B panneau gauche et central, n = 6, * P = 0,044 pour P7, * P = 0,038 pour P14 ; Fichier supplémentaire 3 : Fig. Panneau du milieu S7, n = 6, * P = 0,037 pour P14) induit par l'injection de LPS. En conséquence, les troubles cognitifs induits par une inflammation néonatale sévère ont été significativement améliorés par l'injection d'IL-1β-siARN et/ou de KCC2-siARN (Fig. 4F-4H, 4K, n = 10–15, * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001), indiquant que l'inhibition de l'élévation de l'expression de l'IL-1β et/ou du KCC2 pendant la période de développement GABAergique a pu prévenir la déficience cognitive à long terme induite par une inflammation néonatale sévère.

Ensuite, nous avons abordé les effets de l'inflammation néonatale sur les propriétés électrophysiologiques intrinsèques des neurones pyramidaux CA1 de rats à P7-P10, P14-P16 et P28-P32 (Fig. 5A). Le potentiel d'inversion du GABA (EGABA) a été déterminé pour tester directement les changements dans l'homéostasie du chlorure des tranches de CA1 suite à une inflammation néonatale sévère. L'inflammation néonatale a provoqué un changement hyperpolarisant significatif dans EGABA à la fois en P7-P10 (Fig. 5B-5D, n = 10–12 cellules de 4–5 rats, *** P <0,001) et P14-P16 (Fig. 5F-5H , n = 7 cellules de 3 à 4 rats, ** P < 0,01), accompagné d'un potentiel de membrane au repos hyperpolarisé (RMP) (Fig. 5E, n = 9 à 14 cellules de 5 à 6 rats, ** P < 0,01 ; Fig. 5I, n = 10–13 cellules de 4–5 rats, ** P < 0,01). La suppression de l'expression de l'IL-1β ou de l'expression de KCC2 a atténué le changement hyperpolarisant induit par l'inflammation néonatale dans EGABA (Fig. 5M-5O, n = 7–8 cellules de 3–4 rats, * P = 0, 02 vs LPS + IL-1β- groupe siRNA, * P = 0,033 vs groupe LPS + KCC2-siRNA ; Fig. 5Q-5R, n = 5–7 cellules de 3–4 rats, * P = 0,02, ** P < 0,01) et RMP hyperpolarisée (Fig 5P, n = 7 à 11 cellules de 4 à 5 rats, * P = 0,025 par rapport au groupe LPS + IL-1β-siARN, * P = 0,023 par rapport au groupe LPS + KCC2-siARN ; Fig. 5S, n = 7 -9 cellules de 3 à 4 rats, * P = 0,022 vs LPS + groupe IL-1β-siRNA, * P = 0,011 vs LPS + groupe KCC2-siRNA) à la fois P7-P10 et P14-P16. Aucune différence significative n'a été trouvée dans l'EGABA (Fig. 5J-5K, n = 6–7 cellules de 3–4 rats, P > 0,05) ou la RMP (Fig. 5L, n = 8–10 cellules de 4–5 rats , P > 0,05) chez les rats P28-P32 entre les groupes LPS et témoin.

EGABA est hyperpolarisé dans les neurones pyramidaux CA1 de rats après une inflammation sévère néonatale. (A) Schéma illustrant l'ordre chronologique utilisé pour la livraison de siRNA, l'administration de LPS et les enregistrements de patch perforés. Quinze portées ont été utilisées dans cette cohorte d'expérimentation. (B) Traces représentatives des courants induits par le GABA au potentiel de maintien de -80 à -30 mV par incréments de 10 mV de neurones hippocampiques à P7-P10. ( C ) Courbe courant-tension (IV) des courants induits par le GABA enregistrés à différents potentiels de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones pyramidaux à P7-P10. (D) Valeurs EGABA par cellule obtenues à partir de toutes les courbes IV indiquant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P7-P10 (n = 10–12 cellules de 4–5 rats). (E) Valeurs RMP montrant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P7-10 (n = 9–14 cellules de 5–6 rats). (F) Traces représentatives des courants induits par le GABA au potentiel de maintien de -80 à -30 mV par incréments de 10 mV de neurones hippocampiques à P14-P16. ( G ) Courbe courant-tension (IV) des courants induits par le GABA enregistrés à différents potentiels de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones pyramidaux à P14. (H) Valeurs EGABA par cellule obtenues à partir de toutes les courbes IV indiquant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P14-P16 (n = 7 cellules de 3 à 4 rats). (I) Valeurs RMP montrant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P14-P16 (n = 10–13 cellules de 4–5 rats). ( J ) Courbe courant-tension (IV) des courants spontanés induits par le GABA enregistrés à différents potentiels de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones pyramidaux à P28-P32. (K) Valeurs EGABA par cellule obtenues à partir de toutes les courbes IV indiquant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P28-32 (n = 6–7 cellules de 3–4 rats). (L) Valeurs de RMP montrant un changement hyperpolarisant chez les rats septiques à P28-P32 (n = 8 à 10 cellules de 4 à 5 rats). (M) Traces représentatives des courants induits par le GABA au potentiel de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones hippocampiques à P7-P10 après injection d'ARNsi. ( N ) Courbe courant-tension (IV) des courants induits par le GABA enregistrés à différents potentiels de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones pyramidaux à P7-P10 après injection d'ARNsi. ( O ) Valeurs d'EGABA par cellule obtenues à partir de toutes les courbes IV à P7-P10 après injection d'ARNsi (n = 7 à 8 cellules de 3 à 4 rats). (P) Valeurs de RMP à P7-P10 après injection d'ARNsi (n = 7 à 11 cellules de 4 à 5 rats). ( Q ) Courbe courant-tension (IV) des courants induits par le GABA enregistrés à différents potentiels de maintien de - 80 à - 30 mV par incréments de 10 mV de neurones pyramidaux à P14-P16 après injection d'ARNsi. (R) Valeurs d'EGABA par cellule obtenues à partir de toutes les courbes IV à P14-P16 après injection d'ARNsi (n = 5 à 7 cellules de 3 à 4 rats). (S) Valeurs de RMP à P14-P16 après injection d'ARNsi (n = 7–9 cellules de 3–4 rats). LPS : lipopolysaccharide ; NS : solution saline normale ; EGABA : potentiel d'inversion GABA ; Les panels D, E, H, I, K et L ont été comparés par le test t de Student bilatéral non apparié ; Les panels O, P, R et S ont été comparés par ANOVA unidirectionnelle avec des mesures répétées suivies d'un test post hoc de Tukey ; * P < 0,05, ** P < 0,01 et *** P < 0,001, ns : non significatif ; Les barres d'erreur indiquent SD

La présente étude révèle qu'une inflammation néonatale sévère peut induire une déficience cognitive durable chez les rats adolescents via une régulation à la hausse de la signalisation IL-1β/KCC2 au cours du développement néonatal, accompagnée d'une accélération du passage GABAergique de la dépolarisation à l'hyperpolarisation.

Il est généralement reconnu que l'inflammation du SNC joue un rôle essentiel dans le développement de troubles cognitifs durables suite à une inflammation précoce [35, 36]. Les cytokines pro-inflammatoires, en particulier l'IL-1β, jouent un rôle important dans le processus d'inflammation du SNC après une inflammation néonatale [16, 17]. De plus, l'IL-1β est bien connue pour influencer les mémoires et l'apprentissage dépendant de l'hippocampe [37]. Conformément aux preuves précédentes [10], nos résultats ont montré que l'IL-1β, mais pas l'IL-6 et le TNF, était maintenu à un niveau élevé au moins jusqu'au jour postnatal 30 après l'injection de LPS à P3. Notamment, la réduction de l'expression de l'IL-1β a considérablement atténué les troubles cognitifs de longue durée induits par l'inflammation néonatale, confirmant le rôle important des niveaux élevés et soutenus d'IL-1β dans ce trouble.

Le GABA dépolarise les neurones immatures au cours des premiers jours postnatals [38, 39]. Au cours de la maturation neuronale, il y a un changement fonctionnel médié par le GABA de la dépolarisation à l'hyperpolarisation par régulation positive de l'exportateur de chlorure KCC2, conduisant à un changement négatif du potentiel d'inversion des ions chlorure [20, 38, 40]. Les insultes pendant de telles fenêtres temporelles de développement peuvent induire des conséquences à long terme [27, 40]. Ici, nous avons proposé que l'inflammation néonatale puisse altérer l'expression de KCC2, affectant ainsi le changement GABAergique au cours du développement, ce qui peut contribuer à une déficience cognitive durable. Comme prévu, nos résultats ont démontré que l'inflammation néonatale augmentait l'expression de KCC2, maintenant ainsi une concentration plus faible de Cl– intracellulaire, comme en témoigne un EGABA hyperpolarisé. Notamment, l'inactivation de l'expression de KCC2 atténue les troubles cognitifs induits par l'inflammation néonatale et inverse l'EGABA hyperpolarisé. Pour déterminer si KCC2 est une cible en aval de l'IL-1β, nous avons examiné l'expression de KCC2 et EGABA après l'injection d'IL-1β-siRNA chez des rats LPS. En conséquence, l'inactivation de l'expression de l'IL-1β peut inverser l'expression modifiée de KCC2 et EGABA. Par conséquent, nos résultats indiquent que la régulation à la hausse de KCC2 au cours du développement a médié les effets des niveaux élevés d'IL-1β sur les troubles cognitifs de longue durée. Alors que Corradini et al. ont rapporté que l'infection maternelle par l'acide polyinosinique-polycytidylique (PolyI: C) provoque une régulation négative de la transcription de KCC2 dans le cortex des souris descendantes, entraînant ainsi un décalage GABAergique excitateur à inhibiteur retardé et une plus grande sensibilité aux crises in vivo, qui perdure jusqu'à l'âge adulte [27]. Ces anomalies n'ont pas été observées chez les souris knock-out pour le récepteur de l'interleukine-1 de type I [27]. Leurs découvertes semblent être contraires à nos résultats, qui peuvent résulter des différentes régions du cerveau et de la fenêtre temporelle de l'inflammation. Des études antérieures ont confirmé que la fonction de transmission GABAergique dépendait de la région, comme le cortex par rapport à l'hippocampe [18,19,20]. De plus, la dose plus élevée de LPS utilisée dans la présente étude peut également contribuer à un tel écart. En résumé, leurs découvertes et nos résultats suggèrent ici un lien entre IL-1β/KCC2 et le changement GABAergique au cours du développement ; et a confirmé que le changement GABAergique anormal, qu'il s'agisse d'une accélération ou d'un retard, peut entraîner des anomalies neurodéveloppementales.

Gomez et al. ont constaté que l'inflammation précoce augmente l'excitabilité des neurones pyramidaux CA1 chez les souris mâles adultes, comme en témoigne un potentiel d'inversion GABA dépolarisé résultant d'une expression accrue de NKCC1 [13]. Par conséquent, leurs découvertes et nos résultats mettent en évidence le rôle de l'homéostasie du chlorure dans les propriétés membranaires intrinsèques durables des neurones de l'hippocampe après une inflammation précoce, bien que certaines divergences existent. Dans notre étude actuelle, nous n'avons pas observé de différence significative entre les sexes dans les troubles cognitifs à long terme induits par une inflammation sévère néonatale. De plus, nos résultats ont montré que la régulation à la hausse de KCC2 joue le rôle causal. Les moments d'administration du LPS peuvent être la principale cause de l'écart : l'inflammation néonatale a été induite par l'injection de LPS au 14e jour postnatal (P14) dans l'étude de Gomez [13], alors que le LPS a été injecté au P3 dans cette étude. Dans l'étude de Gomez et al. [13], des enregistrements de patchs de neurones pyramidaux de l'hippocampe CA1 ont été réalisés à l'adolescence (P35-P45) ou à l'âge adulte (P60-P70) et ont montré un EGABA dépolarisé. Pendant cette étude, des enregistrements de patch ont été enregistrés à P7-P10 et/ou P14-P16 et ont montré un EGABA hyperpolarisé. Des preuves antérieures ont montré que le changement GABAergique était peut-être presque terminé après P14 [20] ; par conséquent, l'inflammation induite au stade précoce par rapport au stade presque complet du changement GABAergique peut conduire à des résultats différents. De plus, l'inflammation à un âge avancé proche de l'adolescence peut être susceptible de provoquer des troubles cognitifs dépendants du sexe. Il convient de noter, comme mentionné ci-dessus, que la dose plus élevée de LPS utilisée dans la présente étude peut également contribuer à un tel écart. Contrairement à la dose de LPS (0,1 mg kg−1, ip) dans l'étude de Gomez [13] et une autre étude [41], nous avons utilisé une dose plus élevée de LPS (1 mg kg−1, ip) qui a abouti à ~ 40% mortalité. Par conséquent, une dose aussi élevée de LPS ressemble à un modèle de septicémie plutôt qu'à une inflammation néonatale. Fait important, nous avons effectué des expériences comportementales et démontré que la régulation à la hausse de KCC2 et l'accélération du changement GABAergique sont un contributeur important aux troubles cognitifs induits par l'inflammation néonatale. Une limitation est que nous n'avons pas testé si un effet similaire a été observé chez les rats adultes comme rapporté par Gomez et ses collègues [13]. De futures études sont nécessaires pour déterminer si l'effet de l'inflammation néonatale est limité à une fenêtre temporelle spécifique.

Outre KCC2, NKCC1 joue également un rôle central dans le développement neuronal du cerveau immature [18, 42]. NKCC1 a été suggéré comme une cible thérapeutique importante pour diverses maladies neurodégénératives. Par exemple, la déficience cognitive dans un modèle murin de schizophrénie était associée au potentiel d'inversion des courants GABAA dans les neurones pyramidaux du cortex préfrontal infralimbique résultant d'une expression accrue de NKCC1, qui pourrait être améliorée par le bumétanide [43]. Dans un modèle murin de syndrome de Down, le knockdown de NKCC1 in vivo sauve les déficits cognitifs dans diverses tâches comportementales [44]. Le traitement par le bumétanide, un antagoniste de NKCC1, pendant une période de développement vulnérable sauve l'épilepsie dans un modèle génétique de souris épileptiques [45]. De plus, Gomez et ses collègues ont confirmé le rôle de NKCC1 dans les propriétés membranaires intrinsèques induites par l'inflammation au début de la vie dans les neurones de l'hippocampe [13]. Cependant, une étude a révélé que NKCC1 dans les neurones glutamatergiques télencéphaliques ne semble pas être essentiel pour les principaux aspects du développement de l'hippocampe [46]. Dans de futures études, il sera intéressant de déterminer le rôle de NKCC1 dans les troubles cognitifs induits par l'inflammation néonatale.

Dans la présente étude, des rats ont été testés pour le conditionnement contextuel de la peur dépendant de l'hippocampe et indépendant de l'hippocampe [47]. L'inflammation néonatale sévère a affecté le conditionnement contextuel dépendant de l'hippocampe, mais pas le conditionnement de la peur. Ces données, ainsi que les résultats d'apprentissage spatial et de mémoire détectés par les tests cognitifs du labyrinthe aquatique de Morris dépendant de l'hippocampe, mettent en évidence l'importance de l'hippocampe dans les troubles cognitifs de longue durée induits par une inflammation sévère néonatale.

L'expression de KCC2 et d'EGABA est revenue aux niveaux de contrôle chez les rats adolescents après une inflammation néonatale, soulevant la question suivante : quelle est la cause directe du dysfonctionnement cognitif à long terme au moment de la mesure comportementale ? Bien que la présente étude n'ait pas proposé de données directes, il est possible que KCC2 ait des rôles modulateurs à multiples facettes dans le développement neuronal liés aux fonctions cognitives, comprenant principalement le réglage de la force et de la polarité des courants GABA pendant la maturation neuronale, la régulation de la dynamique du cytosquelette via son C-terminal domaine, modulant l'apoptose développementale, contrôlant les événements précoces du réseau, ainsi que impliqué dans la formation et la plasticité des épines dendritiques corticales [18]. Par conséquent, toute anomalie dans l'une ou l'autre des fonctions mentionnées ci-dessus peut contribuer aux défauts cognitifs à long terme induits par l'inflammation néonatale. Par exemple, il est possible qu'une inflammation précoce et/ou un changement GABAergique influence le développement de la transmission glutamatergique excitatrice [20, 48], entraînant ainsi une altération de la fonction glutamatergique à l'adolescence. De futures études sont nécessaires pour déterminer pourquoi la régulation à la hausse de KCC2 au début de la période de développement provoque une déficience cognitive à long terme à l'adolescence ou même à l'âge adulte.

Il convient de noter qu'il existe des effets bien connus du transport pour les mères gestantes [49, 50]. Par conséquent, le transport des mères enceintes n'est pas recommandé pour les études de développement et devrait être évité dans les expériences futures. Dans cette étude, bien que les témoins et les mères de chiots enflammés aient été également exposés au transport, il est possible qu'une interaction entre le stress de transport et l'inflammation induite par le LPS puisse exister.

En résumé, nos résultats mettent en évidence un lien mécaniste entre l'expression de l'IL-1β/KCC2 et les troubles cognitifs durables dans un modèle d'inflammation néonatale sévère et fournissent une cible moléculaire sous-jacente pour prévenir et/ou traiter les troubles cognitifs après une inflammation septique précoce.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Système nerveux central

Potentiel d'inversion du GABA

Dosage immuno-enzymatique

Conditionnement de la peur

Acide γ-aminobutyrique

Interleukine-1 bêta

K+-Cl– co-transporteur 2

Lipopolysaccharide

Labyrinthe d'eau de Morris

Na+-K+-2Cl– co-transporteur 1

Solution saline normale

Jour postnatal 3

Le potentiel de la membrane au repos

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N'est pas applicable.

Ce travail a été soutenu par la subvention n° 82071687 (à Han Huang) et n° 81974164 (à Cheng Zhou) de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine ; Subvention n° 2021M692276 (à Donghang Zhang) de la China Postdoctoral Science Foundation ; et subvention n° 21PJ014 (à Donghang Zhang) de la Commission de la santé du programme de la province du Sichuan.

Donghang Zhang, Yujiao Yang et Yaoxin Yang ont contribué à parts égales à ce travail.

Département d'anesthésiologie, Hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan, Chengdu, 610041, Chine

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu et Tao Zhu

Laboratoire d'anesthésie et de médecine de soins intensifs, Centre de recherche conjoint national-local en médecine translationnelle d'anesthésiologie, Hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan, Chengdu, 610041, Chine

Donghang Zhang, Yaoxin Yang, Jin Liu et Cheng Zhou

Département d'anesthésiologie, Hôpital affilié du Collège médical du nord du Sichuan, Nanchong, 637000, Chine

Yujiao Yang

Département d'anesthésiologie et laboratoire clé des malformations congénitales et des maladies connexes des femmes et des enfants, ministère de l'Éducation, deuxième hôpital de Chine occidentale de l'université du Sichuan, Chengdu, 610041, Chine

Han Huang

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CZ et HH ont contribué à la conception de l'étude. DZ, YY1 et YY2 ont contribué à la conduite de l'étude. CZ, DZ, JL et TZ ont contribué à l'analyse des données. CZ, DZ et HH ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Han Huang ou Cheng Zhou.

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité d'éthique animale de l'hôpital de Chine occidentale de l'Université du Sichuan (Réf : 2020013) (Chengdu, Sichuan, Chine) et a été mené conformément aux directives de la recherche animale : déclaration des expériences in vivo (ARRIVE). Aucun humain n'a été inclus dans cette étude.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

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Images originales pour les résultats de Western Blot.

Tableau. S1 : Informations statistiques pour la Fig. 1. Tableau. S2 : Informations statistiques pour la Fig. 2. Tableau. S3 : Informations statistiques pour la Fig. 3. Tableau. S4 : Informations statistiques pour la Fig. 4. Tableau. S5 : Informations statistiques pour la Fig. 5. Tableau. S6 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 1. Tableau. S7 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 2. Tableau. S8 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 4. Tableau. S9 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 5. Tableau. S10 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 6. Tableau. S11 : Informations statistiques pour la figure supplémentaire 7.

Fig. S1 : Tâche MWM et test FC pour les rats mâles et femelles après une inflammation néonatale. Fig. S2 : Résultats de Western blot montrant les niveaux de protéines de l'IL-1β hippocampique à P7, P14 et P30 après exposition au LPS. Fig. S3 : Images représentatives montrant la fluorescence portée par IL-1β-siARN ou KCC2-siARN. Fig. S4 : Niveaux d'ARNm et de protéines de KCC2 hippocampique avec développement chez les rats des deux sexes. Fig. S5 : niveaux d'ARNm d'IL-1β et de KCC2 hippocampiques chez des rats P7, P14 et P30 après injection d'ARNsi. Fig. S6 : Niveaux de protéines de l'IL-1β hippocampique chez les rats P7, P14 et P30 après injection d'ARNsi. Fig. S7 : Les niveaux de protéines de KCC2 hippocampique chez les rats P7, P14 et P30 après injection d'ARNsi.

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Reçu : 07 mars 2022

Accepté : 13 juin 2022

Publié: 27 juillet 2022

DOI : https://doi.org/10.1186/s12916-022-02434-w

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