Roman Vénétine

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 18497 (2022) Citer cet article

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La présente recherche montre l'activité antitumorale d'un complexe protéine-polysaccharide Venetin-1 obtenu à partir du fluide cœlomique des vers de terre Dendrobaena veneta contre les cellules cancéreuses A549. Les investigations sont une continuation des expériences sur l'activité antitumorale du fluide cœlomique obtenu à partir de cette espèce. La nanoparticule de Venetin-1 a été obtenue après traitement thermique du fluide cœlomique, séparation des cœlomocytes, filtration et lyophilisation. La préparation a montré un effet sélectif sur les cellules cancéreuses, alors que les cellules normales n'étaient pas affectées. La vénétine-1 était efficace contre les cellules cancéreuses du poumon à des doses de 31,3 et 62,5 µg/ml, et les résultats ont été imagés par microscopie optique et microscopie électronique à balayage (MEB). Les cellules meurent principalement par la voie de l'apoptose. Des cellules nécrotiques sont apparues sporadiquement sur la vue microscopique. L'imagerie SEM a révélé la destruction complète des cellules A549 après l'incubation avec Venetin-1. Les analyses de microscopie à force atomique (AFM) ont montré des changements dans la topographie, les images d'erreur de force maximale et le module de Young (élasticité) des cellules A549 après l'incubation avec Venetin-1. L'analyse par cryomicroscopie électronique à transmission (Cryo-TEM) a indiqué une nature polymérique de la préparation analysée. Les échantillons de Venetin-1 ont montré un profil de taille très homogène avec une taille de microparticule d'environ 58,23 nm. Une diminution significative de la liaison de Venetin-1 à la sphingomyéline a été observée. La vénétine-1 a perdu son activité porogène ou une désactivation de l'activité porogène s'est produite. Ceci confirme l'absence de capacité hémolytique de la Vénétine-1 vis-à-vis des globules rouges. Les analyses menées montrent la pertinence du complexe obtenu pour la recherche biomédicale. La prochaine étape consistera en des analyses de l'effet de Venetin-1 sur le système immunitaire chez la souris.

Dans le groupe des maladies non transmissibles, les cancers sont les causes les plus fréquentes de décès. Le cancer du poumon se caractérise par la mortalité la plus élevée chez les hommes et les femmes dans le monde1,2. Le tabagisme est la cause la plus fréquente de développement du cancer du poumon. La fumée de tabac contient environ 4 000 substances, dont environ 50 composés classés comme toxiques, irritants ou cancérigènes1,3,4. Les personnes exposées au tabagisme passif sont également à risque de cancer du poumon. Les métabolites de la nicotine peuvent être détectés dans l'urine du fumeur passif, ce qui indique que les non-fumeurs inhalent divers composants de la fumée de tabac3. Les composants de la fumée de tabac provoquent des troubles du génome cellulaire, par exemple une délétion ou une amplification de l'ADN, une méthylation incorrecte et même une perte ou un gain de chromosomes entiers2.

Si 85 % des cancers du poumon se développent chez les fumeurs de tabac, les autres cas sont diagnostiqués chez ceux qui n'ont jamais fumé. L'une des causes non liées au tabac des cancers du poumon est la pollution de l'air, principalement la présence d'oxygène soufré, d'oxygène azoté ou de poussière d'un diamètre inférieur à 2,5 µm5,6. Aux États-Unis, la principale cause de cancer du poumon est le radon, c'est-à-dire le produit de la désintégration du radium présent dans le sol. Ce gaz est la cause de 40 % des décès par cancer, et la plupart de ces patients sont des non-fumeurs à vie1. Les chercheurs ont également identifié des gènes responsables de la susceptibilité au développement du cancer du poumon, à savoir des mutations germinales des gènes p53 et EFGR, le polymorphisme du gène SNP ou des troubles des gènes de réparation de l'ADN, par exemple ERCC12,7.

Les cancers du poumon sont diagnostiqués chez des personnes âgées d'environ 70 ans. Ils peuvent être classés en deux types principaux : SCLC (Small Lung Carcinoma) et NSCLC (Non-Small Lung Carcinoma). Environ 85 % des cancers du poumon sont des NSCLC2. Ils ont souvent un mauvais pronostic en raison de la détection tardive et du stade avancé de développement du cancer8. Les SCLC sont souvent situés dans les voies respiratoires plus larges, provoquant des occlusions bronchiques. Ces cancers sont souvent assez gros et métastasent souvent aux ganglions lymphatiques9.

Il a été documenté que de nombreux composés d'origine naturelle végétale, fongique ou animale peuvent détruire les cellules cancéreuses du poumon. Par exemple, l'extrait de basilic asiatique d'Ocimum sanctum a présenté une cytotoxicité pour les cellules cancéreuses du poumon A549, a augmenté la population sous-G1 et a influencé l'apparition de corps apoptotiques dans les cellules cancéreuses10. D'autres études ont montré que Phyllanthus était capable d'induire une toxicité sélective sur les cellules A549. De plus, il a exercé un effet inhibiteur aux stades critiques de la métastase, y compris la migration et l'invasion11. À leur tour, Ramalakshmi et al.12 ont découvert une activité cytotoxique de l'extrait d'éthanol de feuilles de Coleus amboinicus contre les cellules cancéreuses du poumon A549. Sa cytotoxicité après 72 h d'incubation avec des cellules cancéreuses pulmonaires A549 était de 94 %.

Wei-Sheng et al.13 ont montré que la bostricine (hydroxy-méthoxy-tétrahydro-5-méthylanthracène) provenant de champignons marins inhibait la prolifération des cellules A549 en fonction de la dose et du temps d'incubation, arrêtait le cycle cellulaire à G0/G1, et apoptose stimulée. Il a été démontré que la pycnidione isolée du champignon Theissenia rogersii réduit la prolifération des cellules d'adénocarcinome pulmonaire A549 via l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1. De plus, il s'est avéré qu'il stimulait l'apoptose par des voies externes et internes. La pycnidione a également provoqué une diminution du potentiel membranaire mitochondrial et une augmentation significative du niveau d'espèces réactives de l'oxygène et de la protéine PAI-1 dans les cellules A54914. En médecine chinoise, les propriétés anticancéreuses des composés isolés de Ganoderma spp. contre le cancer du poumon sont bien connus15.

Concernant les préparations d'origine animale, Arulvasu et al.16 ont montré que l'émulsion d'huile de sardine (Sardinella longiceps) induisait l'apoptose et inhibait la prolifération des cellules cancéreuses pulmonaires A549 de manière dose-dépendante et temps d'incubation. Le mécanisme d'action probable des acides Ω-3 consiste en une interaction avec la membrane cellulaire et une inhibition des enzymes membranaires, ce qui conduit à l'apoptose des cellules néoplasiques. Concernant les invertébrés, il a été observé que les protéines du liquide cœlomique des vers de terre présentent également une activité antitumorale, par exemple contre le cancer du poumon17.

Les vers de terre sont une source de substances anticancéreuses. Ces annélides sont utilisés en médecine extrême-orientale, par exemple au Vietnam, en Chine ou en Corée, pour le traitement de nombreuses maladies, telles que les brûlures, l'asthme, la bronchite, les maladies cardiovasculaires ou les ulcères gastro-intestinaux17,18. Dans leur habitat riche en microbiote et assurant un contact permanent entre les micro-organismes et les vers de terre, ces animaux ont développé des mécanismes empêchant le développement de maladies18,19,20,21. Les formulations les plus populaires à base de vers de terre sont les poudres et les pâtes20,21,22,23,24. Il a été démontré que le liquide cœlomique est riche en protéines, enzymes, peptides et polysaccharides. Il a des propriétés fibrinolytiques, exerce des effets vasorelaxants et possède des propriétés bénéfiques pour le foie17,18,22. Les préparations de vers de terre ont des propriétés antibactériennes et antifongiques documentées20,21,24,25,26,27,28. Les recherches actuelles ont démontré que le liquide cœlomique a une activité anticancéreuse contre les lignées cellulaires cancéreuses HeLa, A549, Pa17, PC-12 ou Hep-220,26,29. Un mécanisme d'action du fluide cœlomique contre les cellules cancéreuses basé sur la limitation de l'absorption de glucose par les cellules a été proposé20. De plus, il a été démontré que le liquide cœlomique n'a aucun effet cytotoxique sur les fibroblastes ou les érythrocytes humains25,30. Ces propriétés font des produits dérivés des vers de terre des agents prometteurs dans le traitement du cancer.

Les effets de Venetin-1 sur la prolifération des cellules BEAS-2B et A549 ont été déterminés à l'aide du test MTT pendant 24, 48 et 72 h (Fig. 1). Bien que la lignée cellulaire A549 était d'environ 80 à 90 % viable après l'exposition de 24 et 48 h aux différentes concentrations de vénétine-1 (15,6 à 500 μg/mL), sa viabilité après l'incubation de 72 h a considérablement diminué à 52 %. , 41 % et 32 ​​% aux concentrations de Venetin-1 de 125 μg/mL, 250 μg/mL et 500 μg/mL, respectivement (Fig. 1A). La viabilité des cellules BEAS-2B a diminué à 75 % dans le groupe traité à 500 μg/mL de Venetin-1 à 72 h (Fig. 1B). Aux concentrations les plus faibles, les cellules BEAS-2B semblaient présenter une tolérance plus élevée à la vénétine-1, avec une plus grande viabilité (80 à 100 %) à toutes les autres concentrations de vénétine-1 après la période de 72 h.

Résultats du test MTT et effets des concentrations indiquées de Venetin-1. (A) Courbes dose-réponse pour la vénétine-1 dans les cellules A549 après 24 h, 48 h et 72 h d'incubation. (B) Comparaison de l'activité cytotoxique de Venetin-1 contre les cellules A549 du cancer du poumon et les cellules BEAS-2B normales après 72 h d'incubation. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD) à partir de 3 expériences indépendantes. *p < 0,05 ; **p < 0,01. La vénétine-1 à une concentration comprise entre 125 et 500 μg/mL après l'incubation de 72 h a provoqué une diminution significative de la viabilité des cellules A549, mais n'a induit aucun changement significatif dans la viabilité des cellules BEAS-2B.

La mort cellulaire apoptotique induite par l'extrait de Venetin-1 a été étudiée en surveillant la translocation de la phosphatidylsérine (PS) à l'aide du test Annexin V-FITC/PI. Sur la base de la capacité de l'annexine V à se lier à la PS, qui est localisée dans le feuillet de la membrane interne des cellules viables, les cellules ont été classées comme suit : LL—cellules viables (annexine V−/PI−), LR—cellules apoptotiques précoces ( Annexine V+/PI-), UR-cellules apoptotiques tardives (Annexine V+/PI+) et UL-cellules nécrotiques (Annexine V-/PI+).

Nous avons observé que le traitement de 72 h avec Venetin-1 avait un impact nécrotique et apoptotique sur les cellules A549 (Fig. 2). Le nombre de cellules viables a chuté de manière significative de 77,03 ± 2,62 % dans le contrôle à 48,41 ± 0,92 % après l'incubation de 72 h avec 125 µg/mL de Venetin-1. Par rapport aux cellules témoins, une quantité accrue de cellules nécrotiques (~ 5 %) et de cellules apoptotiques précoces (~ 3 %) a été observée dans les cellules A549 traitées avec Venetin-1. De plus, les cellules présentaient un taux d'apoptose tardive remarquablement plus élevé, par rapport aux cellules non traitées (24,31 ± 0,57 contre 2,18 ± 0,27) (tableau 1). Les résultats de l'activité de Venetin-1 contre les cellules épithéliales pulmonaires normales (BEAS-2B) sont présentés dans les documents supplémentaires (Fig. S1 supplémentaire).

Activité apoptotique et nécrotique de la vénétine-1 dans les cellules A549 évaluée avec le test de coloration à l'annexine V/PI. Le panneau (A) montre des parcelles de points représentatives de cellules témoins A549 (sans incubation avec Venetin-1) après double coloration avec Annexin V-FITC et PI. Le panneau (B) montre les effets de l'incubation avec Venetin-1 (125 µg/mL) pendant 72 h sur l'apoptose cellulaire dans les cellules A549. Les cellules ont été classées en cellules viables (carré inférieur gauche), cellules apoptotiques précoces (carré inférieur droit), cellules apoptotiques tardives (carré supérieur droit) et cellules nécrotiques (carré supérieur gauche). Des images représentatives de trois expériences indépendantes sont présentées. La vénétine-1 a eu un effet nécrotique et apoptotique sur les cellules A549. Le taux de nécrose ainsi que d'apoptose précoce et tardive dans les cellules A549 traitées à la Venetin-1 était plus élevé de 5 %, 3 % et 22,13 %, respectivement, que dans le témoin.

Pour examiner l'effet potentiel du traitement Venetin-1 sur le cycle cellulaire, les cellules A549 ont été traitées avec 125 µg/mL de Venetin-1 pendant 72 h, colorées avec PI et soumises à une analyse par cytométrie en flux. Comme le montre la Fig. 3, les cellules A549 traitées ont été arrêtées à la phase sous-G1 avec une augmentation substantielle (p < 0,0001) du nombre de cellules apoptotiques (1,13 ± 0,08 % contre 36,63 ± 0,61 %). L'incubation avec Venetin-1 a également provoqué une diminution concomitante de la proportion de cellules au G1 (40,94 ± 0,94 % contre 30,44 ± 0,57 %, p = 0,0001), S (25,56 ± 0,65 % contre 18,36 ± 0,50 %, p = 0,0001) et phases G2/M (31,36 ± 0,35 % contre 15,32 ± 0,38 %, p < 0,0001) du cycle cellulaire dans les cellules A549 traitées, par rapport au témoin.

Effet du traitement Venetin-1 sur les phases du cycle cellulaire A549. (A) Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux dans les cellules témoins A549 et celles traitées avec Venetin-1 (125 µg/mL) pendant 72 h. La distribution du cycle cellulaire des cellules marquées PI a été analysée par des analyses de cytométrie en flux. Les pics de l'illustration correspondent aux phases sous-G1 (porte M1), G1 (porte M2), S (porte M3) et G2/M (porte M4) du cycle cellulaire. (B) Histogramme montrant les pourcentages de cellules à chaque phase du cycle cellulaire. Les résultats sont exprimés en valeurs moyennes ± SD de trois expériences indépendantes. Les valeurs de p inférieures à 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01), par rapport au groupe témoin, sont considérées comme statistiquement significatives. Le traitement Venetin-1 a provoqué l'arrêt des cellules A549 à la phase sous-G1 avec une augmentation du nombre de cellules apoptotiques et une réduction visible des proportions de cellules A549 traitées et témoins aux autres phases du cycle cellulaire.

Le niveau de caspases 3, 6, 8, 9, 12 et 18 a été déterminé dans des homogénats de cellules normales et néoplasiques avec et sans vénétine-1 (Fig. 4). Dans la culture des cellules cancéreuses pulmonaires A549, le taux de chacune des caspases testées était plus élevé dans les cultures supplémentées en Venetin-1 à la concentration de 125 µg/mL que dans les cultures non traitées. Le taux de caspases dans la culture des cellules BEAS-2B normales avec l'ajout de Venetin-1 à la concentration de 125 µg/mL n'a pas différé significativement entre les deux groupes étudiés.

Concentrations de caspases 3, 6, 8, 9, 12 et 18 dans les cultures cellulaires BEAS-2B et A549. *p < 0,05. La plus forte augmentation de la concentration des caspases testées a été observée dans la culture des cellules cancéreuses du poumon A549 traitées avec Venetin-1.

Après l'incubation avec Venetin-1 (125 µg/mL), la plus forte augmentation de la concentration des caspases 3, 6, 8 et 9 a été enregistrée dans la culture des cellules cancéreuses pulmonaires A549. La plus forte augmentation de la concentration de caspase 12 a été enregistrée dans la culture de cellules de cancer du poumon A549 incubée avec le composé actif (Fig. 4). Une légère diminution de la concentration de caspase 12 a été notée dans la culture de cellules BEAS-2B avec l'ajout de Venetin-1 (125 µg/mL). La plus forte augmentation de la concentration de caspase 18 après l'incubation avec Venetin-1 a été notée dans la culture des cellules cancéreuses du poumon A549. Une légère diminution de la concentration de caspase 18 a été observée dans la culture de cellules normales incubées avec Venetin-1. Les données complètes sont disponibles dans les documents supplémentaires (tableau supplémentaire S2).

L'analyse de la culture témoin A549 et des variants incubés avec 62,5 et 125 µg/mL de Venetin-1 a montré que les cellules traitées avec la fraction active étaient moins nettement perceptibles sous le cristallin et étaient déformées. Des changements cytopathiques ont été fréquemment observés dans les cellules. De plus, des cellules fortement dégradées ou en désintégration étaient visibles (Fig. 5a).

Visualisation de cellules A549 traitées à la Venetin-1 avec l'utilisation de la lumière transmise et de la microscopie à fluorescence : (a) effet cytotoxique de la Venetin-1 sur A549. A—Culture témoin A549, B—A549 après 72 h d'incubation avec Venetin-1 (62,5 µg/mL) à 78 % de cytotoxicité ; C1, C2—A549 après 72 h d'incubation avec Venetin-1 (125 µg/mL) à 48 % de cytotoxicité. Les cellules ont été visualisées à l'aide d'un microscope Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss). La barre d'échelle correspond à 20 µm. Les images représentent 10 images. Les cellules traitées par Venetin-1 ont été déformées et dégradées ; ( b ) effets apoptotiques et nécrotiques sur les cellules A549 après 72 h d'incubation avec Venetin-1. A - culture témoin de A549, B - cellules A549 traitées avec Venetin-1 (62,5 µg/mL), C1, C2 - cellules A549 traitées avec Venetin-1 (125 µg/mL). Les flèches jaunes indiquent les cellules apoptotiques avec une dégénérescence progressive claire du noyau. Les cellules roses sont considérées comme nécrotiques. Les barres d'échelle correspondent à 50 µm. Chaque image représente 10 photos capturées.

Les cultures observées au microscope à lumière transmise ont également été imagées à l'aide d'un microscope confocal après application d'un mélange de colorants fluorescents pour identifier les cellules nécrotiques et apoptotiques. Les cellules témoins étaient caractérisées par un noyau fluorescent foncé régulier. Les cellules incubées avec Venetin-1 aux concentrations de 62,5 et 125 µg/mL avaient des noyaux lumineux brillants avec du matériel génétique fréquemment fragmenté. Les cellules montrant des signes d'apoptose sont marquées dans l'image par des flèches. Les cellules nécrotiques étaient sporadiques et émettaient une fluorescence rouge (Fig. 5b).

La culture témoin et les cellules incubées avec Venetin-1 à la concentration de 125 µg/mL ont été observées en utilisant la technique DIC. La technique assure l'effet d'une surface tridimensionnelle. Il a été observé que les cellules A549 témoins étaient visiblement plus denses et compactes en vue microscopique, comme indiqué par leur couleur plus foncée et une plus grande diversité de la surface observée (Fig. 6a A). Après le traitement à la Venetin-1, les cellules se sont contractées, ce qui a été mis en évidence par la pigmentation foncée concentrée sur la surface cellulaire plus près de leur centre (Fig. 6a B1, B2). La microscopie électronique à balayage des cellules tumorales a facilité la comparaison de leurs surfaces entre les groupes de contrôle et d'incubation de Venetin-1 (125 µg/mL). La surface des cellules témoins était riche en structures granulaires fines (Fig. 6a A1, A2), alors que les cellules traitées à la vénétine-1 n'avaient pas ces granules et leur surface cellulaire présentait des restes de structures endommagées (Fig. 6b B1, B2 ). L'effet de contraction cellulaire était également visible sous forme de fissures discernables dans l'image microscopique (Fig. 6b B1).

Analyse DIC et SEM des cellules A549 après exposition à la Venetin-1 : (a) Images DIC des cellules A549 après traitement à la Venetin-1 A—culture témoin de cellules A549 B1, B2—A549 après incubation avec la Venetin-1 (125 µg/mL ). Les barres d'échelle correspondent à 20 µm. ( b ) Images SEM de la surface des cellules A549 après traitement à la Venetin-1. A1, A2 - culture témoin de cellules A549, B1, B2 - A549 après incubation avec Venetin-1 (125 µg/mL). Les barres d'échelle correspondent à 10 µm. Après incubation avec Venetin-1, la contraction et la dégradation des structures cellulaires étaient visibles à la surface des cellules A549. Chaque image représente 10 photos capturées.

Les images topographiques et d'erreur de force maximale capturées par AFM à la surface des cellules A549 incubées avec 125 µg/mL de Venetin-1 ont révélé des différences (Fig. 7B1, B2) par rapport aux cellules témoins (Fig. 7A1, A2). L'amplitude moyenne des cellules témoins A549 soumises à la mesure de la hauteur était deux fois inférieure à l'amplitude moyenne des cellules traitées avec Venetin-1. Les cellules A549 incubées avec Venetin-1 avaient une surface très variée avec des indentations visibles dans le profil de hauteur (Fig. 7B1, B2). Afin de déterminer les surfaces cellulaires avec la plus faible et la plus grande élasticité, une carte du module de Young a été réalisée et les valeurs du module de Young pour les zones données ont été comparées. La valeur moyenne du module de Young des zones avec la plus grande élasticité était de 2120,7 MPa dans le contrôle et de 1142,8 MPa dans les cellules A549 traitées avec Venetin-1. Le module de Young des zones avec la plus faible élasticité était 2,3 fois plus faible (2647,4 MPa) dans les cellules A549 incubées avec Venetin-1 que dans les cellules témoins (6300,9 MPa). Dans les deux cas, les différences étaient statistiquement significatives (p < 0,001 ; test T de Student). Les images AFM ont indiqué des changements morphologiques et biophysiques apoptotiques dans les cellules A549 causés par le traitement Venetin-1.

Analyse AFM de la surface de la paroi cellulaire A549. (A1, A2) Culture témoin de A549, (B1, B2) Cellules cancéreuses incubées avec 125 µg/mL Venetin-1. Image de l'erreur de haute altitude et de force maximale - panneau de gauche ; profil de hauteur et image 3D—panneau de droite. Le traitement à la vénétine-1 a provoqué des changements dans la topographie de la paroi cellulaire et les propriétés mécaniques des cellules A549, et une élasticité significativement plus faible exprimée en module de Young a été observée.

Avant la digestion enzymatique des composants protéiques de Venetin-1 et DVr (fluide cœlomique brut), les échantillons ont été réduits avec du DTT et soumis à une séparation électrophorétique dans le système automatique SageELF. Les protéines ont été séparées en mode basé sur la taille dans la gamme 10–300 kDa. Après séparation, le système a automatiquement élué les protéines du gel dans des puits séparés de la cassette, à partir desquels elles ont été pipetées dans des tubes Eppendorf et digérées selon le protocole FASP (chaque fraction séparément). Les résultats d'identification des protéines pour la vénétine-1 dans chaque fraction sont présentés dans le tableau 2 (tous les résultats sont disponibles dans les documents supplémentaires, tableau S3 pour la vénétine-1 et S4 pour le fluide cœlomique brut DVr). L'identification a été effectuée sur la base de la base de données révisée sur les protéines d'Annelida (Uniprot).

La liaison de la préparation de Venetin-1 et de son précurseur - DVr (fluide cœlomique brut) collecté à partir de vers de terre et non traité (sans chauffage ni dialyse) à deux lipides : la sphingomyéline et le POPC a été déterminée. Des solutions de liposomes 3 mM ont été préparées selon la procédure décrite dans la section Matériels et méthodes. Les lipides ont été déposés sur le capteur L1 conçu pour étudier l'interaction des protéines avec les lipides. Ensuite, après avoir bloqué le capteur avec une solution d'albumine, la procédure de liaison des deux préparations a été effectuée, et les protéines liées ont été éluées et soumises à une analyse protéomique. Les sensorgrammes présentés sur la figure 8 montrent la liaison des préparations aux lipides. Il y avait une réduction significative de la liaison de Venetin-1 à la sphingomyéline par rapport à la préparation de DVr non transformée. Une liaison plus faible de DVr au lipide POPC a été détectée. La liaison de Venetin-1 à POPC était plus faible et était associée à un détachement rapide du complexe.

Analyse SPR d'extraits protéiques (DVr—liquide cœlomique brut et Venetin-1) se liant à la SM (sphingomyéline) et à la POPC (1-palmitoyl-2-deoylphpsphatydilcholine). Les changements observés étaient liés à la réduction de la liaison de Venetin-1 à la sphingomyéline par rapport à la préparation de DVr non traitée, à la liaison plus faible de DVr au lipide POPC et à la liaison plus faible de Venetin-1 à POPC.

L'analyse protéomique des fractions de récupération des expériences SPR a montré qu'une seule protéine a été identifiée dans chaque cas, à savoir la protéine 2 liée à la lysénine (LRP2). La couverture de séquence la plus élevée et la plupart des peptides ont été identifiés dans DVr. Pour plus de détails, voir le tableau S5 dans les documents supplémentaires.

Le composé actif Venetin-1 était visible au microscope à balayage sous forme de petits flocons de différentes tailles. Les structures les plus longues mesuraient environ 200 µm de long (Fig. 9A1, A2). La structure de la préparation a également été observée à l'aide de la technique Cryo-TEM. Il a été remarqué que les plus petites structures se regroupaient pour former une structure circulaire plus grande. L'accumulation des structures plus petites est indiquée par le cercle blanc sur la figure 9B, tandis que les structures lâches sont indiquées par des flèches. Une forme ronde et compacte est visible dans la partie supérieure du spécimen. L'image observée suggère que la structure Venetin-1 est caractéristique d'un composé polymère.

Imagerie de Venetin-1 : (A1, A2) images SEM de Venetin-1 ; (B) Imagerie Cryo-TEM de Venetin-1. L'image montre de petites structures regroupées en une plus grande (marquée d'un cercle blanc). Les structures lâches sont marquées par des flèches. Une structure compacte circulaire sombre formée de particules plus petites est visible dans la partie supérieure de l'image.

L'analyse a montré la présence de carbone (64,1%), d'oxygène (23,5%), d'azote (6,3%), de phosphore (1,6%) et de soufre (0,3%). Tous ces éléments sont caractéristiques des protéines. Les tests ont également montré la présence de chlore (3,0 %) et de sodium (1,3 %).

Le spectre d'enquête XPS de Venetin-1 est illustré à la Fig. 10. Les résultats quantitatifs de l'analyse XPS de la composition élémentaire de la surface de Venetin-1 sont présentés dans le tableau 3.

Spectre d'enquête XPS de Venetin-1. Des éléments caractéristiques des protéines ont été détectés, notamment : le carbone, l'azote, le phosphore et le soufre ; de plus, la présence de chlore et de sodium a été démontrée.

Pour identifier les liaisons chimiques présentes dans la préparation analysée, des spectres dans une gamme étroite d'énergies de liaison pour le carbone, l'oxygène, l'azote, le soufre et le phosphore ont été obtenus. Après une opération d'ajustement de sélection basée sur les données de la littérature, les liaisons chimiques ont été ajustées pour les énergies de liaison individuelles. La figure 11 montre les spectres dans une plage étroite d'énergie de liaison XPS. Le tableau 4 présente la composition élémentaire de la vénétine-1 avec identification des liaisons chimiques caractéristiques.

Spectres XPS de Venetin-1 dans une gamme étroite d'énergies de liaison pour : (a) le carbone, (b) l'oxygène, (c) l'azote, (d) le phosphore, (e) le soufre.

L'étude a montré les caractéristiques de liaison des polysaccharides et des protéines. Les spectres dans la gamme étroite des énergies de liaison pour le carbone ont montré la présence de liaisons C–C, C–H, C–OH, C=O et C–O–C dans les polysaccharides. La présence de la liaison carboxylique O = C – OH caractéristique des protéines a également été observée. Les groupes C = O et C – N caractéristiques de la liaison peptidique ont également été trouvés. Les essais réalisés dans la gamme étroite d'énergie de liaison caractéristique de l'azote ont montré la présence d'azote sous forme de liaisons amines. Ces liaisons sont caractéristiques des protéines. La présence de la forme organique du phosphore et du soufre confirme également la présence de protéines dans la préparation testée.

Comme on le voit sur la figure 12 et le tableau 5, les échantillons affichent un profil d'analyse de taille très homogène avec la taille des microparticules déterminée à 58,23 ± 3,93 nm.

Analyse de taille Prometheus Panta DLS des microparticules de vénétine-1. La préparation s'est avérée homogène dans le profil de taille.

Suite à l'analyse granulométrique réalisée avec Prometheus Panta, a été réalisée une expérience de température de fusion avec un gradient de température de 25 à 95 °C et une rampe de chauffage de 1 °C/min (tableau 6). Comme le montre la figure 12, les microparticules affichent une transition unique de 350/330 nm à une température de 64,95 ± 0,08 °C. Cette transition correspondait très probablement au point de fusion des microparticules analysées. De plus, il a été déterminé qu'après le changement conformationnel représenté par le rapport de fluorescence 350/330 nm, les microparticules analysées ont subi une agrégation avec le Tagg 66,92 ± 0,16 °C et un début d'agrégation 58,97 ± 1,15 °C.

Les sources renouvelables de médicaments d'origine animale, les préparations pharmaceutiques basées sur ces sources et les additifs alimentaires biologiques semblent faire partie intégrante des progrès dans la recherche d'agents thérapeutiques efficaces. Ce type d'activité humaine devrait être amélioré de toutes les manières possibles. Des modèles animaux pratiques contribuent au développement d'une médecine complémentaire et alternative appelée médecine intégrative. Des invertébrés tels que les vers de terre sont peu coûteux, non controversés sur le plan éthique et utiles pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux processus biologiques37. L'utilisation de produits pharmaceutiques dérivés de vers de terre est très développée en tant que médecine verte en Chine et dans d'autres pays asiatiques. Les extraits préparés à partir de ces invertébrés sont utilisés pour traiter de nombreuses maladies. Parmi les invertébrés, les vers de terre sont une source connue de composés antibactériens, antifongiques et anticancéreux. Le liquide cœlomique de la cavité corporelle du ver de terre présente de nombreux types de propriétés biologiques, par exemple une activité antimicrobienne, protéolytique, hémolytique, hémagglutinante, antifongique et antitumorale.

Nos recherches montrent que la vénétine-1, précédemment caractérisée comme la fraction protéique-polysaccharidique du liquide cœlomique du ver de terre D. veneta, a un effet sélectif sur les cellules du carcinome pulmonaire A549, détruisant les cellules cancéreuses et sauvant les cellules normales. La préparation a été obtenue par plusieurs processus, tels que l'extraction du fluide au moyen d'un choc électrique, la centrifugation, la filtration, l'incubation et la lyophilisation. Une étape particulièrement importante consistait à priver le fluide de la cytotoxicité vis-à-vis des cellules normales tout en maintenant son activité élevée contre les cellules tumorales. Ces processus ont été décrits dans la publication décrivant l'action des fractions du liquide cœlomique sur les cellules cancéreuses pulmonaires A54929.

La préparation obtenue a provoqué la mort cellulaire par apoptose. Du point de vue de l'oncologie moderne, l'apoptose est un processus très important à activer dans les cellules cancéreuses. Les cellules cancéreuses sont immortelles par nature. On tente de concevoir des médicaments modernes pour induire l'apoptose (ou un autre type de mort cellulaire) uniquement dans les cellules anormales, laissant intactes les cellules saines du corps. En d'autres termes, la tumeur est pharmacologiquement induite à se suicider. L'induction du processus d'apoptose est l'un des principaux objectifs des thérapies anticancéreuses conçues. Ceci est lié aux mécanismes développés de résistance des cellules tumorales à la mort programmée. Les médicaments chimiothérapeutiques actuels tuent les cellules cancéreuses principalement par induction de l'apoptose. Cependant, ils deviennent inefficaces lorsque la cellule néoplasique peut métastaser, ce qui est associé à un mauvais pronostic et à une mortalité élevée38. Les cellules cancéreuses ont généralement plusieurs mutations génétiques qui affectent le processus apoptotique, évitant ainsi la mort cellulaire programmée. Cette résistance à l'apoptose est bénéfique pour les cellules métastatiques38,39,40,41,42.

Les protéines cibles sont protéolysées par les caspases, ce qui peut entraîner leur activation ou leur inhibition, exerçant ainsi un impact significatif sur le devenir futur de la cellule. Ils remplissent de nombreuses fonctions importantes dans l'organisme. Surtout, ces protéines jouent un rôle clé dans l'apoptose. De plus, ils sont impliqués dans d'autres mécanismes de mort cellulaire tels que la pyroptose, la nécrose et l'autophagie. Ils sont également importants dans le fonctionnement du système immunitaire et dans les processus inflammatoires par stimulation de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires. Ils participent également aux processus de vieillissement. Certaines caspases ont des propriétés anticancéreuses43,44,45,46,47. Les caspases initiatrices (caspases 2, 8, 9 et 10) sont impliquées dans la phase initiale de l'apoptose, et leur rôle est d'amplifier le signal de mort. Ils sont également responsables de l'activation des caspases effectrices (caspases 3, 6, 7). À leur tour, après activation, les caspases exécutrices décomposent rapidement les éléments cellulaires43,47,48.

Les présents résultats indiquent que la vénétine-1 provoque une augmentation statistiquement significative de l'activité de la caspase dans les cellules cancéreuses du poumon A549 en culture. L'augmentation de la concentration de la caspase 3, qui appartient au groupe des caspases exécutrices, et la diminution du nombre de cellules vivantes dans la culture peuvent indiquer une intensification du processus d'apoptose dans ces cellules tumorales après l'ajout de Venetin-1. Cependant, l'augmentation de la caspase 12 suggère que cette préparation peut également jouer un rôle important dans l'induction du processus inflammatoire. L'augmentation de la concentration de la caspase 6 indique que la Vénétine-1 influence la phase d'exécution de l'apoptose, et l'augmentation de la concentration des caspases 8 et 9 reflète leur influence sur la phase d'initiation. À son tour, aucun changement significatif dans les paramètres testés n'a été trouvé après l'ajout de Venetin-1 dans la culture de cellules normales de l'épithélium bronchique de l'arbre bronchique BEAS-2B.

Les observations en microscopie optique, en microscopie électronique à balayage et en microscopie à force atomique ont révélé des changements dans la morphologie et les propriétés nanomécaniques des cellules tumorales après l'incubation avec la vénétine-1. Les images microscopiques fournies par les différentes techniques se complétaient. La microscopie à lumière transmise a montré une diminution de la densité cellulaire et une déformation après l'incubation avec le composé actif. Des changements dans les paramètres de surface cellulaire A549, tels que la rugosité, ont été détectés par microscopie à force atomique. L'apoptose précoce est caractérisée par un remodelage du cytosquelette et du noyau. Il induit des changements dynamiques dans les propriétés nanomécaniques de la surface cellulaire49. Macroscopiquement, la réduction de la densité de culture a également été mise en évidence par la technique DIC.

La Venetin-1 isolée a provoqué une augmentation significative du niveau des caspases 3, 12 et 18 dans les cellules cancéreuses du poumon A549 et a en même temps induit des changements dans la viabilité et la densité cellulaires dans ces cultures. Cela indique que cette préparation exerce son effet antitumoral en stimulant le processus d'apoptose dans les cellules cancéreuses du poumon A549.

Bien que nous décrivions notre préparation comme une fraction protéine-polysaccharide, il s'agit en fait d'un complexe, car les analyses électrophorétiques précédentes de celle-ci ont montré que les signaux provenant des protéines étaient situés exactement aux mêmes positions que les signaux provenant des sucres. Cela indique que ces composés de protéines et de sucres sont liés les uns aux autres. De plus, les analyses par spectroscopie FTIR ont prouvé l'homogénéité chimique de la préparation, puisque le spectre FTIR était le même dans chaque région analysée et avait la même intensité. Une autre observation à l'appui de la nature du complexe est l'image Cryo-TEM de la préparation, qui montrait clairement des structures plus petites identiques fusionnant en une forme sphérique plus grande. Les analyses XPS des liaisons chimiques confirment cette théorie. De plus, les analyses spécifiques au domaine de diffusion dynamique de la lumière réalisées avec l'utilisation de Prometheus Panta ont montré que la vénétine-1, auparavant considérée comme une fraction protéine-polysaccharide, était une nanoparticule.

Des analyses chimiques antérieures effectuées dans des études sur l'activité antifongique27,28,30 ont montré que les protéines de la famille des lysénines : la protéine 2 liée à la lysénine (LRP2) et la lysénine, qui ont été identifiées avec une précision de 95 % et 90 % de couverture de séquence, respectivement, étaient les principaux composants de Venetin-1. La lysénine est une protéine de 33 kDa présente dans le liquide cœlomique des vers de terre50. Probablement, la lysénine est produite par les coelomocytes et les chloragocytes libres, puisque l'ARNm de la lysénine a été trouvé dans ces cellules. La lysénine se lie spécifiquement à la sphingomyéline (SM) et, lorsqu'elle est liée aux membranes cellulaires des cellules cibles, elle forme des oligomères de manière dépendante de la MS. Ces protéines appartiennent au groupe des toxines porogènes, qui peuvent être responsables de l'activité biologique de la préparation.

Le système SageELF (électrophorèse latérale fractionnement) a été utilisé pour la séparation des composants protéiques de DVr et Venetin-1. Il est utilisé pour le fractionnement des protéines dans une matrice de gel d'agarose SDS avec élution simultanée. Le logiciel contrôle le temps de fractionnement en fonction du signal du marqueur fluorescent ajouté pendant les étapes de préparation de l'échantillon. De cette manière, les fractions obtenues ont été divisées selon la taille moléculaire de 10 à 300 kDa. L'analyse protéomique a confirmé la présence de quantités significatives de constituants dans tous les éluats. Dans le cas de la vénétine-1, la plus grande part dans la fraction 9 (éluée de 8 à 10) est la forme monomérique de la lysénine, de l'actine 2 et de la protéine 2 apparentée à la lysénine. Cependant, ce n'est pas la seule forme présente dans l'ensemble. préparation. Une fréquence élevée de cette forme estimée par les paramètres du programme PeaksStudio (tableau supplémentaire S3) a été observée dans des fractions de poids moléculaire plus élevé, à partir desquelles des molécules d'un poids d'environ 260 kDa (fraction 1) à 100 kDa (fraction 4) ont été éluées. En supposant que la masse du monomère est la masse de lysénine ou de LRP2 (33/34 kDa), ceux-ci peuvent être des formes trimères à octamères s'il s'agit de lysénine homogène ou d'oligomères LRP2 hétérogènes sous la forme d'un mélange de lysénine et de LRP2. Leurs séquences sont très similaires (identité 89%). En raison de la présence d'actine 2 (42 kDa) et par exemple de fragments d'ubiquitine identifiés dans toutes les fractions, on suppose également qu'il peut s'agir d'un complexe multiprotéique. L'analyse sensorgramme a révélé des différences entre Venetin-1 et DVr dans l'interaction avec les lipides. Les données pour DVr sont cohérentes avec les rapports de la littérature indiquant que les lysénines sont des protéines qui reconnaissent spécifiquement la sphingomyéline51. Dans le cas de Venetin-1, une diminution significative de la liaison à la sphingomyéline a été observée. Cela peut suggérer une perte de la capacité à former le pore plein caractéristique de cette protéine ou la formation d'oligomères non fonctionnels lors du chauffage du fluide cœlomique brut. La vénétine-1 peut toujours interagir avec le SM, mais l'interaction est beaucoup plus faible. Ceci est également visible dans le cas du POPC, qui imite les membranes des mammifères. DVr exerce un effet plus faible que SM, mais l'interaction dans le cas de Venetin-1 est encore plus faible. L'identification des protéines de la fraction de récupération a révélé la protéine 2 liée à la lysénine en tant que protéine de liaison aux lipides pour les deux préparations testées. LRP-2 présente 89 % d'identité et 94 % de similarité avec la séquence de la lysénine, et les données de la littérature indiquent que la LRP se lie au SM et induit l'hémolyse des globules rouges, de même que la lysénine51. Structurellement, ils partagent des sites putatifs de N-glycosylation et de N-myristoylation. Les résultats montrent que l'interaction de la vénétine-1 avec les lipides est basée sur LPR2 mais pas sur la lysénine.

La vénétine-1 a perdu son activité porogène ou une désactivation de l'activité porogène a eu lieu. Cela a été confirmé par le manque de capacité hémolytique de la vénétine-1 vis-à-vis des globules rouges et a démontré une réduction significative de la toxicité de la vénétine-1 contre les cellules saines et l'absence d'hémolyse des globules rouges, par rapport à la préparation DVr. La fraction DVr a dégradé les RBC, tandis que leur incubation avec la Venetin-1 n'a pas altéré ces cellules et n'a pas provoqué de libération de leur contenu (données non présentées dans le manuscrit). Ainsi, l'interaction des formes monomères ou oligomères avec la surface de la membrane sans formation de pores et de perforation de la membrane peut être analogue dans les cellules cancéreuses. Le processus de formation des pores consiste en trois étapes principales au contact de la membrane : liaison des monomères solubles à la membrane, assemblage/oligomérisation et incorporation complète de la forme poreuse dans la membrane lipidique52,53. La vénétine-1 lie des monomères ou éventuellement des oligomères solubles à la membrane, mais les deux autres étapes semblent être en quelque sorte inhibées.

Selon l'état actuel des connaissances médicales, il existe encore un besoin de développer de nouveaux médicaments qui, seuls ou en synergie avec d'autres médicaments, agiront efficacement contre le cancer du poumon non à petites cellules. Le cancer du poumon fait partie des néoplasmes de très mauvais pronostic car il est souvent diagnostiqué trop tard. La base du traitement de la plupart des cancers est la thérapie combinée, c'est-à-dire l'utilisation de techniques chirurgicales, de radiothérapie et de chimiothérapie. Le type de thérapie dépend du stade de la tumeur et de l'efficacité globale du patient. Au cours d'une maladie cancéreuse et d'une chimiothérapie, une infection fongique peut se développer chez le patient comme une complication grave. Dans ce cas, il est très important de connaître à la fois les activités des cytostatiques anticancéreux et leurs interactions avec les médicaments antifongiques. Les agents chimiothérapeutiques utilisés en oncologie avec des propriétés antifongiques appartiennent à différents groupes de médicaments cytostatiques. Ceux-ci comprennent les antimétabolites dérivés du platine, les inhibiteurs de l'ADN topoisomérase et les modulateurs des récepteurs des œstrogènes. La vénétine-1, précédemment décrite comme une fraction protéine-polysaccharide, a montré une activité antifongique efficace contre C. albicans sans endotoxicité ni cytotoxicité pour les cellules cutanées humaines normales54.

En plus de l'activité antitumorale contre les cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules A54929,55, la fraction a un effet cytotoxique sur les cellules cancéreuses du côlon56,57. De plus, il a été montré que la Vénétine-1 active les macrophages humains in vitro et provoque la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires (protéines messagères) : interleukine 6 (IL-6) et interleukine 1β (IL-1β) par ces cellules. L'invention a été brevetée par l'Office polonais des brevets58. La vénétine-1 peut être utilisée comme composant d'une préparation augmentant la résistance aux infections (par exemple, un médicament immunostimulant) ou améliorant localement la réponse immunitaire (par exemple, comme adjuvant ajouté aux vaccins bactériens ou viraux). Étant donné que des études ont montré que la Venetin-1 présente une activité antitumorale directe, l'effet immunostimulant montré suggère la possibilité d'utiliser la Venetin-1 chez les patients cancéreux pour restaurer le bon fonctionnement du système immunitaire et combattre le cancer ou pour compléter l'immunodéficience après une chimiothérapie.

La recherche d'un facteur actif à activité antimicrobienne et antitumorale chez le ver de terre D. veneta est menée par notre équipe de recherche depuis plus de 10 ans. Dans un premier temps, ces études ont abouti à l'isolement de la bactérie symbiotique Raoultella ornithinolytica du tractus gastro-intestinal de cette espèce. Les métabolites extracellulaires de cette bactérie produisent des composés antibactériens, antifongiques et anticancéreux59,60,61,62,63. Une séparation effectuée au moyen de méthodes chromatographiques est nécessaire pour isoler l'agent actif. Il était difficile d'obtenir une quantité suffisante de la substance d'essai, et le coût élevé de la séparation était une autre limitation.

L'étape suivante consistait à essayer d'isoler le composé actif du fluide cœlomique. Cette étape de la recherche a été couronnée de succès et a produit une grande quantité de substance active avec des méthodes bon marché. La séparation par dialyse a été appliquée après incubation à température élevée pour éliminer la cytotoxicité. Dans ce cas, la seule limitation est le nombre d'individus librement ajustables.

La méthode d'acquisition de Venetin-1 est bon marché, rapide à réaliser à tout moment et adaptée à un usage commercial. Actuellement, nous avons obtenu l'autorisation du comité de bioéthique pour mener des recherches sur un modèle de souris, et la dose qui stimulera efficacement le système immunitaire de l'animal sera déterminée prochainement. La préparation sera administrée par voie intrapéritonéale par injection, car cela semble être le meilleur moyen d'éviter la perte de la préparation et de maintenir la dose efficace. Après avoir déterminé les propriétés immumodulatrices, Venetin-1 sera injecté à des animaux atteints d'un cancer du poumon pour déterminer l'effet inhibiteur.

L'effet anticancéreux des nanoparticules actives de D. veneta sur les cellules cancéreuses du poumon A549, confirmé par la présente recherche, pourrait permettre l'utilisation d'un médicament sûr et efficace contre le cancer du poumon. Le développement d'un tel médicament serait une percée dans la thérapie de cette maladie.

Des vers de terre Dendrobaena veneta ont été cultivés dans des conditions de laboratoire au Département d'immunobiologie de l'Université Maria Curie-Skłodowska (Lublin, Pologne). Les invertébrés ont été conservés dans des contenants de 3 L remplis de terre de compost à une température de 20 °C dans l'obscurité totale. Les vers de terre étaient nourris avec des légumes bouillis et des feuilles de thé vert. Le régime était enrichi en lignine cellulose, nécessaire à la production de cocons.

Les vers de terre adultes ont été maintenus sur de la lignine humide pendant 24 h pour nettoyer l'intestin. Ensuite, le liquide cœlomique (CF) a été collecté à partir de groupes de 10 individus de vers de terre par électrostimulation douce (4,5 V). Le CF a été récolté dans du NaCl à 0, 9% et centrifugé à 2500 × g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les coelomocytes. Cela a donné un surnageant acellulaire, qui a été stérilisé par filtration à travers des filtres Millipore avec une taille de pores de 0,22 µm. Le CF acellulaire a été incubé pendant 10 min à 70 ° C pour éliminer les propriétés cytotoxiques. Ensuite, il a été transféré dans un sac à membrane de cellulose avec un seuil de coupure de 12 à 14 kDa. Les échantillons ont été dialysés dans de l'eau pendant 24 h à 4 °C. Après la dialyse, la Venetin-1 a été lyophilisée. La préparation a été conservée à -20°C. La concentration en protéines a été estimée dans les échantillons lyophilisés en utilisant la méthode de Bradford (Bio-Rad, USA)64. Le fluide cœlomique non chauffé et non dialysé (liquide cœlomique brut - DVr) a été utilisé pour les analyses protéomiques.

Des cellules épithéliales bronchiques humaines (BEAS-2B) et des cellules épithéliales d'adénocarcinome pulmonaire (cellules A549) ont été cultivées dans des boîtes de culture tissulaire en polystyrène de 100 mm dans du milieu RPMI 1640 (Gibco, Invitrogen, USA) contenant 8% de FBS (Gibco, Invitrogen, USA) et 5 % de pénicilline/streptomycine (Gibco, Invitrogen, États-Unis) dans un incubateur humidifié à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d'air. Les cellules ont été systématiquement passées par trypsinisation et sous-cultivées à une densité de placage initiale de 2 × 105 pendant 72 h. Les cellules BEAS-2B ont été fournies pour la recherche par le Dr Dorota Ścieglińska du Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology (Gliwice, Pologne). Les cellules A549 provenaient de la culture cellulaire de l'Université de médecine de Lublin (Pologne).

Le dosage du méthyl thiazol tétrazolium (MTT) a été utilisé pour déterminer la cytotoxicité de la vénétine-1 envers les cellules cancéreuses du poumon BEAS-2B et A549. Dans un premier temps, les cellules ont été ensemencées dans une plaque à 96 puits à une densité de 1 × 104 cellules/puits et laissées adhérer à 37 °C dans un incubateur à CO2 pendant 24 h. Le lendemain, le milieu a été remplacé par un nouveau milieu additionné de diverses concentrations de Venetin-1 : 15,6, 31,3, 62,5, 125, 250 et 500 µg/mL. Chaque plaque à 96 puits a été configurée avec des groupes de contrôle (cellules uniquement) et d'ajustement zéro (milieu uniquement). Le test a été réalisé en triple. Après 24, 48 et 72 h, le milieu de culture a été remplacé par un nouveau et les cellules ont été incubées avec 20 µL de solution de travail MTT (Invitrogen, CA USA) (5 mg/µL) à 37 °C pendant 4 h . Le surnageant a ensuite été éliminé et les cristaux de formazan violet ont été solubilisés dans 100 μl/puits de diméthylsulfoxyde (DMSO) suivi d'une incubation (1 h). L'absorbance de la solution de formazan a été mesurée à 550 nm avec un lecteur de plaques Victor 1420 multilabel counter (PerkinElmer, Inc. Waltham, MA USA). Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé à l'aide de la formule suivante : [Viabilité cellulaire (%) = (DO du groupe expérimental - DO du groupe d'ajustement zéro)/(DO du groupe témoin - DO du groupe d'ajustement zéro) × 100 %. Rapport d'inhibition cellulaire (%) = 1 - viabilité cellulaire (%)]. Chaque expérience a été répétée trois fois.

Pour évaluer l'apoptose cellulaire, les cellules A549 ont été ensemencées sur des plaques de microtitration à 6 puits à une densité de 2 × 105 cellules/mL et cultivées pendant 24 h. Ensuite, le milieu de culture a été remplacé par un nouveau (cellules témoins) ou les cellules ont été exposées à 125 µg/mL de Venetin-1 pendant 72 h. Pour déterminer le pourcentage de cellules au sein de la population qui subissaient activement l'apoptose, un kit de détection d'apoptose eBioscience™ Annexin V-FITC (Invitrogen, USA) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules récoltées (~ 5 × 105/mL) ont été remises en suspension dans 200 µL de tampon de liaison (1x), et 195 µL de la suspension cellulaire ont été mélangés avec 5 µL d'Annexine V-FITC après 10 minutes d'incubation à température ambiante. Ensuite, les cellules ont été lavées dans 200 µL de tampon de liaison (1x), remises en suspension dans 190 µL de tampon de liaison (1x) et colorées avec 10 µL d'iodure de propidium (PI) (20 µg/mL). Après 15 minutes d'incubation dans l'obscurité à température ambiante, les cellules ont été analysées sur un cytomètre en flux Guava easyCyte (Merck, Allemagne). Les cellules ont été analysées à l'aide du logiciel InCyte™ de Merck Millipore. 10 000 événements ont été analysés pour chaque échantillon, et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules dans chaque catégorie. Trois expériences indépendantes ont été réalisées.

La progression du cycle cellulaire a été déterminée à l'aide de PI. Les cellules A549 ont été préparées comme décrit ci-dessus pour l'évaluation de l'apoptose cellulaire. Après 72 h, les cellules ont été récoltées, lavées avec du PBS et après centrifugation (300 g, 6 min, 4 ° C) fixées avec de l'éthanol à 70 % glacé à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, ajustées à ~ 1 × 106 cellules et colorées avec la solution de coloration FxCycle™ PI/RNase (Thermo Fisher, USA) conformément aux instructions du fabricant (15 à 30 min à 37 °C) . Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux Guava easyCyte (Merck, Allemagne). 10 000 événements dans cette porte ont été acquis par échantillon.

L'étude impliquait des cultures de cellules BEAS-2B normales et de cellules cancéreuses pulmonaires A549. Les cultures ont été réalisées dans des conditions standard (37 °C, 5 % de CO2 et 90 % d'humidité) à la fois sans et avec l'ajout de Venetin-1. Des kits ELISA CASP humains ont été utilisés pour déterminer la concentration de caspases (FineTest, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd., Chine). La concentration de caspase a été déterminée par ELISA conformément au manuel du fabricant. Les valeurs d'absorbance ont été lues à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (BioRad, USA).

Les cellules cancéreuses A549, à la fois témoins et incubées avec Venetin-1 pendant 72 h (aux concentrations de 62,5 et 125 µg/mL), ont été imagées à l'aide d'un microscope Zeiss Axiovert 40CFL (Carl Zeiss, Allemagne). Les modifications de leur structure ont également été documentées avec la fonction DIC (contraste interférentiel différentiel). La morphologie des cellules a été visualisée à un grossissement de 60x à l'aide d'un microscope Olympus BX61 (Olympus Corporation, Japon).

Les modifications de la morphologie des cellules tumorales A549 caractéristiques de l'apoptose ont été évaluées à l'aide de la microscopie à fluorescence en utilisant un mélange de fluorochrome Hoechst 33342 et de PI (Sigma, Allemagne). Les cellules témoins et traitées à la Venetin-1 ont été imagées avec un microscope Zeiss LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Allemagne) à des longueurs d'onde d'émission d'environ 460 nm et> 575 nm, respectivement. Le mélange de coloration à une concentration de 2,5 μl/mL a été ajouté à la culture cellulaire et les préparations ont été incubées pendant 5 min à 37 °C dans l'obscurité. L'apoptose a été mise en évidence par la fluorescence bleu vif des noyaux de cellules intactes ou fragmentées ; les cellules à noyau rose ont été identifiées comme nécrotiques.

Après l'incubation avec Venetin-1, les cellules A549 du carcinome pulmonaire non petit ont été observées par MEB. Tout d'abord, ils ont été fixés avec du glutaraldéhyde à 4 % dans un tampon phosphate 0,1 M à pH 7,0. Par la suite, les cellules ont été montées sur des lames et colorées avec une solution d'OsO4 à 1 % pendant 1 h, suivie d'une déshydratation dans une série de solutions d'acétone (15 %, 30 %, 50 %, 70 %, 100 %). Les préparations ont été séchées dans un dessiccateur à l'aide de gel de silice pendant 24 h et dorées à l'aide d'une coucheuse K550X (Quorum Technologies, Royaume-Uni). Les cellules fixées ont été analysées à l'aide d'un microscope électronique à balayage Tescan Vega 3 (Tescan, République tchèque).

La structure de Venetin-1 a été observée et documentée avec un microscope électronique à balayage Quanta 3D FEG (FEI, Japon). Une préparation lyophilisée, qui n'avait pas été soumise à une déshydratation standard et à une pulvérisation d'or, a été utilisée pour les observations microscopiques. Cette procédure a permis de visualiser la substance active dans sa forme naturelle.

La surface des cellules cancéreuses témoins et des cellules traitées avec Venetin-1 a été analysée par AFM. Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un microscope NanoScope V AFM fonctionnant en mode PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping avec MultiMode 8 (Bruker, Veeco Instruments Inc.). Il était équipé du logiciel NanoScope 8.15. Le module d'élasticité local a été déterminé à l'aide du module de Derjaguin-Muller-Toporov (DMT). La raideur nominale du ressort de la sonde RTESPA (Bruker, USA) (pointe en silicone sur un levier en nitrure) était de 40 N/m. Le module de Young a été déterminé pour une zone sélectionnée de la surface cellulaire A549. Les échantillons ont été préparés comme décrit pour SEM. Le module de Young a été déterminé pour 20 champs dans chaque échantillon (zones sombres de faible rigidité et zones claires de forte rigidité). Les données ont été analysées statistiquement.

La séparation des protéines de Venetin-1 et du fluide cœlomique brut (DVr) a été réalisée avec le développement du système automatique SageElf (Sage Science, Beverly, MA, USA) dans une cassette de gel SDS-Agarose à 3% (ELP3010). Il permet la séparation des protéines dans la gamme 10–300 kDa. Toutes les solutions nécessaires (Loading buffer) et le marqueur ont été fournis avec les cassettes du set. L'échantillon a été dissous dans une solution de charge pour obtenir une concentration de 200 mg de protéine dans 26 ml. Ensuite, 4 ml de DTT 0,5 M ont été ajoutés à l'échantillon et l'ensemble du mélange a été chauffé pendant 6 min à 85 °C. Après refroidissement, 10 ml de la solution de charge avec le marqueur fluorescent 03 ont été ajoutés à l'échantillon, et l'échantillon a été mélangé. Les protéines ainsi préparées ont été introduites dans une cassette 3% SDS-Agarose. La séparation (mode basé sur la taille) consistait en une élution automatique des protéines du gel pendant 1 h 20 puis 30 min. Le système était piloté par le logiciel SageElf version 1.08. Il a donné 12 fractions de la préparation, qui ont ensuite été digérées en utilisant une procédure FASP standard et de la trypsine (Trypsin Gold, Promega)27,65. Les fractions obtenues à partir de deux séries ont été combinées pour une procédure FASP. Le nettoyage final a été effectué selon la procédure Stage Tips66.

L'enregistrement du spectre a été effectué sur un spectromètre de masse TripleTOF 5600+ (Sciex Framingham, MA, USA) connecté à un système de chromatographie, le système Ekspert MicroLC 200 Plus (Eksigent, Redwood City, CA, USA). Toutes les séparations chromatographiques ont été réalisées sur la colonne ChromXP C18CL (3 µm, 120 Å, 150 × 0,3 mm). Pour chaque échantillon, le gradient chromatographique pour chaque analyse MS était de 11 à 42,5 % B (solvant A : solution aqueuse à 0 %, acide formique à 0,1 % ; solvant B : acétonitrile à 100 %, acide formique à 0,1 %) pendant 60 min. L'ensemble du système a été contrôlé par le logiciel SCIEX Analyst TF 1.7.1. Les mesures de la bibliothèque spectrale ont été acquises en mode d'acquisition dépendant des données (DDA). Chaque cycle de la méthode DDA appliquée comprenait l'accumulation de spectres de précurseurs en 100 ms dans la plage de 400 à 1 200 m/z, suivie de l'accumulation des spectres d'ions produits des 20 premiers précurseurs en 50 ms dans la plage de 100 à 1 800 m/z, résultant dans un temps de cycle total de 1,15 s. Les ions précurseurs anciennement fragmentés ont été dynamiquement exclus.

Le logiciel PeaksStudio XPRO (Bioinfor, Canada) a été utilisé pour la recherche dans la base de données. L'identification des protéines a été réalisée sur la base de la base de données révisée d'Annelida (05.04.2022, Uniprot) avec les paramètres suivants : charge du filtre 2 à 8, tolérance d'erreur pour la masse des précurseurs - 25 ppm, tolérance aux ions fragments 0,5, clivages manqués maximum par peptide - trois modifications fixes - carbamidométhylation, variables - oxydation Met, 1% FDR pour les peptides et les protéines. Les analyses finales ont été effectuées sur la base du résultat du fichier Spider. Les données obtenues ont été déposées dans le référentiel Pride67 sous l'identifiant.

Pour les expériences SPR, des solutions mères de liposomes molaires de sphingomyéline (SM) et de 1-palmitoyl-2-déoylphpsphatydilcholine (POPC) ont été préparées. La solution de liposomes a été préparée comme décrit précédemment68. En bref, des poudres lyophilisées de POPC (Avanti Polar Lipids, USA) et de sphingomyéline (œuf de poule; Avanti Polar Lipids, USA) ont été mises en suspension dans du tampon PBS (Sigma Aldrich, USA). La suspension de phospholipides a été soumise à 10 cycles d'incubation impliquant une incubation de 30 minutes dans un bain à ultrasons avec chauffage (333 K) et une incubation de 30 minutes à 277 K. Ensuite, l'extrusion a été réalisée à l'aide d'un Avanti Mini Extruder (Avanti Polar Lipids, USA) avec une membrane à pores de 0,1 µm. Cette procédure, c'est-à-dire le passage de la solution lipidique à travers l'extrudeuse, a été répétée onze fois. Après l'achèvement de la procédure d'extrusion, l'échantillon était prêt à l'emploi.

La liaison des lipides sphingomyéline (SM) et 1-palmitoyl-2-déoylphpsphatydilcholine (POPC) a été réalisée sur le capteur L1 (Cytiva, USA) à l'aide de l'instrument Biacore T200 (Cytiva, USA). L'interaction des protéines a été analysée après l'immobilisation des lipides (SM ou POPC) sur la surface de la puce capteur L1 comme décrit dans le manuel du fabricant. SM a été immobilisé au niveau de réponse de 3659,96 RU (± 415,45 RU) et POPC a été immobilisé au niveau de réponse de 4995,67 RU (± 570,47 RU). Ensuite, après avoir bloqué le capteur avec une solution d'albumine à 0,5 mg/mL, le protocole standard du fabricant « Injection et récupération » a été utilisé. Les extraits protéiques ont été exécutés sur la surface de la puce du capteur avec des lipides immobilisés permettant la liaison aux protéines. Ensuite, après 30 s d'incubation avec 0,5 % de TFA, les protéines liées ont été récupérées dans 50 µl de NH4HCO3 50 mM. Ensuite, les échantillons récupérés à partir d'au moins deux cellules d'écoulement ont été analysés avec MS. Après toutes les analyses, le spectre de réponse de référence de fond a été soustrait du spectre de réponse expérimental et les résultats ont été présentés sous forme de sensorgrammes.

Les fractions collectées à partir de l'expérience SPR contenant des protéines liées aux lipides testés ont été soumises à une digestion classique dans une solution. Avant l'ajout de trypsine, les échantillons ont été traités avec une solution de DTT 50 mM (45 min, 56 ° C), suivie d'IAA (45 min dans l'obscurité). La digestion à la trypsine a été effectuée pendant une nuit à 37°C. Lorsque la digestion a été arrêtée en abaissant le pH de la solution (1% d'acide formique dans l'eau), les échantillons ont été purifiés par StageTips et concentrés à 30 ml. L'analyse LC-MS/MS et l'identification des protéines ont été réalisées de manière analogique comme dans le cas des échantillons Venetin-1.

La solution Venetin-1 avec une concentration en protéines de 1 mg/mL a été placée dans une chambre à ultrasons (Pol-Sonic, Pologne) pendant 10 min à 40 °C. La suspension aqueuse a ensuite été vitrifiée sur une grille TEM avec un film de carbone perforé (Quantifoil R 2/2 ; Quantifoil Micro Tools GmbH, Großlöbichau, Allemagne). Le maillage a été préalablement activé pendant 15 s dans un plasma d'oxygène à l'aide d'un dispositif Femto (Diener Electronic, Ebhausen, Allemagne). Un échantillon de 3 µL a été appliqué sur le maillage. Ensuite, un buvardage avec du papier filtre et une congélation instantanée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un ventilateur Vitrobot Mark IV (FEI Company, Hillsboro, Oregon, USA) ont été effectués. Les échantillons vitrifiés ont été conservés dans de l'azote liquide jusqu'à leur placement dans un support Cryo-TEM Gatan 626 (Gatan Inc., Pleasanton, USA). Les images de microscopie électronique à transmission cryogénique (cryo-TEM) ont été obtenues à l'aide d'un microscope Tecnai F20 X TWIN (FEI Company, Hillsboro, Oregon, USA) équipé d'un canon à émission de champ (FEG) fonctionnant à une tension d'accélération de 200 kV. Une caméra Eagle 4k HS (FEI Company, USA) a été utilisée pour l'enregistrement des images et un logiciel TIA (FEI Company, USA) a été utilisé pour le traitement.

Les études chimiques de Venetin-1 ont été réalisées à l'aide de la méthode de spectroscopie électronique XPS. Les analyses ont été réalisées dans le système analytique multichambre Prevac UHV (Prevac, Pologne). Après montage sur le support en molybdène, les échantillons de Venetin 1 testés ont été dégazés à température ambiante jusqu'à un vide poussé constant d'environ 5 × 10–8 mbar dans le sas de chargement du système UHV. L'analyse XPS a été effectuée après l'introduction de l'échantillon dans la chambre d'analyse du système UHV. Une source de rayonnement AlKa monochromatique a servi de source d'excitation de photoélectrons. Les photoélectrons ont été excités par un rayonnement X avec une raie caractéristique AlKα et une énergie de 1486,7 eV générés par une lampe VG Scienta SAX 100 avec une anode en aluminium avec un monochromateur VG Scienta XM 780.

Les spectres d'étude ont été réalisés dans une large gamme d'énergies de liaison, en utilisant les paramètres d'analyseur suivants : mode de fonctionnement - balayage, énergie de transition de 200 eV, plage mesurée d'énergie de liaison des photoélectrons de 0 à 1 200 eV, pas de mesure de 0,5 eV, temps de collecte dans un seul pas - 0,2 s, nombre d'itérations - 4.

Après l'exécution du spectre d'étude, les spectres dans une gamme étroite d'énergies de liaison ont également été réalisés pour le carbone, l'oxygène, l'azote, le phosphore et le soufre. Les tests ont été réalisés avec les paramètres d'analyseur suivants : mode de fonctionnement - balayage, énergie de transition 50 eV, pas de mesure - 0,1 eV, temps de collecte en un seul pas - 0,667 s.

Pour les calculs quantitatifs, les spectres obtenus ont été traités avec le logiciel Casa XPS. Les axes X correspondant à l'énergie de liaison ont été calibrés à l'aide du pic de carbone aliphatique C1s. L'énergie de liaison correspondant à ce pic a été supposée être EB = 285,0 eV.

Pour caractériser la taille des microparticules de Venetin-1, nous avons réalisé une expérience DLS à l'aide de l'instrument Prometheus Panta (NanoTemper Technologies GmbH, Allemagne). Les échantillons ont été chargés dans huit capillaires jouant le rôle de répliques où l'analyse parallèle a révélé l'homogénéité des microparticules.

Les données obtenues à partir des analyses protéomiques ont été déposées dans le référentiel PRIDE et sont disponibles sous le numéro d'accession PXD034132.

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L'analyse chimique du composé actif a été soutenue par le projet du Centre national des sciences, Pologne [2020/37/B/NZ7/00763]. Nous tenons à remercier le Dr Dorota Ścieglińska du Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center and Institute of Oncology (Gliwice, Pologne) pour avoir fourni les cellules BEAS-2B.

Faculté intercollégiale de biotechnologie de l'Université de Gdańsk et de l'Université de médecine de Gdańsk, Gdańsk, Pologne

Magda Rybicka, Paulina Czaplewska, Katarzyna Węgrzyn, Agata Szpiech & Natalia Musiał

Département de biologie et de génétique, Université médicale de Lublin, Lublin, Pologne

Jolanta Rzymowska

Laboratoire analytique, Institut des sciences chimiques, Faculté de chimie, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Weronika Sofińska-Chmiel

Département d'immunobiologie, Institut des sciences biologiques, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Sylwia Wójcik-Mieszawska & Marta J. Fiołka

Département de biologie cellulaire, Institut des sciences biologiques, Université Maria Curie-Skłodowska, Lublin, Pologne

Kinga Lewtak

Faculté de chimie, Université de Gdańsk, Gdańsk, Pologne

Przemyslaw Jurczak

Centre de biotechnologie de Malopolska, Université Jagellonne, Cracovie, Pologne

Jakub Nowak

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MF a obtenu un complexe actif de Venetin-1, a effectué des analyses Cryo-TEM et SEM, des préparations AFM, une analyse d'apoptose (Fig.5), a coordonné la recherche et a rédigé le texte principal du manuscrit ; SWM a rédigé l'introduction et réalisé les figures 7, 4 et l'analyse statistique ; JR a effectué une analyse des caspases et une microscopie optique des cellules cancéreuses (Fig. 55 a) ; KL a réalisé les Fig. 4 et Fig. 6 et la littérature ; MR fait une analyse par cytométrie en flux ; Analyse PC des résultats, préparation des mesures SPR, préparation du manuscrit ; KW a effectué des mesures SPR et une compilation des données SPR ; PJ a préparé des liposomes ; AS et NM ont fait la séparation SageElf, la digestion FASP, la préparation et l'analyse de la méthode LC-MS/MS, WSC a fait l'analyse XPS., JN a préparé l'analyse Pantha.

Correspondance à Paulina Czaplewska ou Marta J. Fiołka.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Rybicka, M., Czaplewska, P., Rzymowska, J. et al. Nouvelle nanoparticule de vénétine-1 issue du liquide cœlomique de vers de terre en tant qu'agent prometteur pour le traitement du cancer du poumon non à petites cellules. Sci Rep 12, 18497 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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Reçu : 17 mai 2022

Accepté : 29 septembre 2022

Publié: 02 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-21665-8

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