Les microcapsules de gel d'agarose permettent une

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 17014 (2022) Citer cet article

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Un nouveau type de microcapsule de gel d'agarose (AGM), composé d'un noyau de sol de picolitre d'alginate et d'une enveloppe de gel d'agarose, a été développé pour obtenir un ADN génomique de bactéries amplifié unicellulaire de haute qualité. L'AGM est facile à préparer dans une émulsion stable avec de l'huile de densité équivalente à l'eau, qui empêche l'agrégation d'AGM, avec uniquement un équipement de laboratoire standard. Des cellules individuelles d'une culture pure d'Escherichia coli, une communauté fictive comprenant 15 souches de bactéries intestinales humaines et une communauté bactérienne de l'intestin des termites ont été encapsulées dans des AGM, et leurs échantillons d'ADN génomique ont été préparés avec des amplifications massivement parallèles dans un tube. Le séquençage du génome n'a pas nécessité d'amplification de second tour et a montré une complétude moyenne du génome bien supérieure à celle obtenue avec une méthode d'amplification conventionnelle à l'échelle du microlitre, quelle que soit la teneur génomique en guanine-cytosine. Notre nouvelle méthode utilisant l'AGM permettra à de nombreux chercheurs d'effectuer facilement et efficacement la génomique unicellulaire et peut accélérer l'analyse génomique de micro-organismes encore non cultivés.

Les micro-organismes sont omniprésents dans divers environnements. Ils sont souvent associés à d'autres organismes et jouent un rôle important dans les écosystèmes. Cependant, la majorité des espèces microbiennes sont difficiles à cultiver avec les méthodes conventionnelles et sont appelées micro-organismes encore non cultivés1. Au cours des deux dernières décennies, ils ont été largement étudiés à l'aide de méthodes indépendantes de la culture telles que l'analyse de séquençage d'amplicon de gènes d'ARN ribosomique de petites sous-unités (ARNr SSU) et l'analyse de séquençage de fusil de chasse de métagénomes. La métagénomique est un outil puissant pour étudier les fonctions écologiques et physiologiques du microbiote sur la base de leurs répertoires génétiques codés. Le développement récent du regroupement informatique des fragments métagénomiques en assemblages taxonomiques microbiens respectifs a renforcé l'utilité de la métagénomique2,3. Cependant, le binning informatique basé sur la composition de la séquence, l'homologie avec les séquences de la base de données et la couverture de lecture de la séquence de chaque fragment peut souvent échouer à discriminer les génomes de (sous) espèces étroitement apparentées et à trier correctement les régions génomiques présentant des caractéristiques distinctes des autres, comme l'ARNr. gènes, prophages et plasmides4,5. De plus, un effort massif de séquençage est nécessaire pour obtenir les séquences génomiques d'espèces mineures de la communauté microbienne3.

La génomique unicellulaire, dans laquelle l'ADN génomique entier est amplifié à partir de cellules uniques physiquement isolées6, a été utilisée comme méthode alternative ou complémentaire pour révéler la capacité métabolique de micro-organismes encore non cultivés1,7. L'isolement unicellulaire peut être réalisé dans de nombreux cas en utilisant des technologies telles que le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)1, les micromanipulateurs8, les dispositifs microfluidiques9,10 et l'encapsulation dans des gouttelettes d'eau dans l'huile11. Bien que diverses méthodes d'amplification du génome entier aient été développées12, l'amplification par déplacement multiple (MDA) utilisant l'ADN polymérase phi29 avec des amorces aléatoires est la plus largement utilisée en raison de sa relative simplicité, de sa fiabilité et de son applicabilité6,13. Cependant, MDA démontre intrinsèquement un biais d'amplification extrême parmi les régions du génome1, qui a été la principale limitation technique de la génomique unicellulaire. De plus, la teneur élevée en guanine-cytosine (GC) de l'ADN génomique a tendance à augmenter le biais d'amplification1,14. Le biais d'amplification peut être supprimé à l'aide de petits récipients de réaction ; par exemple, chambres à microcanaux (60 nL)10, micropuits nanolitres (12 nL)15, microfluidique virtuelle (MDA dans une feuille de gel, 60 nL)16, gouttelettes numériques générées à l'aide d'un microcanal (9,5 à 240 pL)17,18, 19 et billes de gel20. Cependant, ces techniques de microfabrication ne sont pas disponibles pour de nombreux microbiologistes, et la quantité de produit d'amplification est souvent trop faible pour le séquençage direct du génome ; par conséquent, un deuxième tour de MDA est souvent nécessaire, ce qui améliore finalement le biais d'amplification21.

Une microcapsule d'hydrogel à noyau creux22, qui se compose d'une coque d'hydrogel et d'un noyau de sol, a un potentiel en tant que récipient efficace pour le MDA à cellule unique. De nombreuses microcapsules d'hydrogel à noyau creux se sont avérées utiles pour la culture cellulaire et la transplantation cellulaire23,24,25. Cependant, le produit MDA de l'ADN génomique unicellulaire amplifié dans un noyau creux à l'échelle du picolitre dans une microcapsule n'a pas été entièrement évalué pour la génomique unicellulaire.

Ici, nous introduisons une nouvelle méthode de génomique unicellulaire utilisant un AGM composé d'une coque de gel d'agarose et d'un noyau creux de sol d'alginate, qui permet l'isolement unicellulaire et le MDA à l'échelle du picolitre (Fig. 1a). La fabrication de l'AGM a été optimisée ici pour une préparation plus facile à l'aide d'équipements et de réactifs peu coûteux, tels qu'un mélangeur vortex, des centrifugeuses et des réactifs disponibles dans le commerce (Fig. 1b), bien que l'uniformité de taille de l'AGM soit sacrifiée par rapport aux méthodes utilisant des techniques de microfabrication26,27 . Ainsi, cet AGM peut être facilement préparé et est évolutif pour de nombreux microbiologistes. En utilisant l'AGM, une seule cellule bactérienne peut être encapsulée dans son noyau de sol à l'échelle du picolitre, puis soumise à la MDA simplement en échangeant des solutions (désignées ici « MDA-in-AGM »). Nous démontrons, en utilisant E. coli, un faux mélange de bactéries intestinales humaines, et le microbiote intestinal des termites, que MDA-in-AGM permet une génomique unicellulaire massivement parallèle avec une complétude du génome bien améliorée par rapport à une méthode conventionnelle utilisant FACS et microlitre- échelle MDA (FACS-MDA).

Vue schématique d'une microcapsule de gel d'agarose (AGM) et de son processus de préparation. ( a ) Schéma de principe de l'AGM développé dans cette étude pour l'isolement unicellulaire et l'amplification à déplacement multiple (MDA). L'AGM se compose d'une enveloppe d'hydrogel d'agarose et d'un noyau de sol d'alginate. Le noyau d'alginate fournit une chambre de réaction à l'échelle du picolitre pour le MDA, tandis que la coque d'agarose agit à la fois comme une enveloppe perméable pour les enzymes et les petites molécules et comme une paroi protectrice contre les particules et molécules plus grosses telles que les cellules bactériennes et l'ADN génomique/amplifié. (b) Schéma de préparation des AGM contenant des cellules d'Escherichia coli. Les noyaux d'alginate et les coquilles d'agarose sont gélifiés avec du Ca2+ à partir de CaCO3 et refroidis dans une émulsion, respectivement. Le polyglycéryl-6 octacaprylate (PGO) peut supprimer l'agrégation des AGM pendant la gélification de l'agarose par refroidissement. Enfin, les noyaux de gel d'alginate sont solatisés avec de l'EDTA en chélatant Ca2+. Alcool isostéarylique ISA.

Pour les noyaux AGM, des billes de gel d'alginate contenant des cellules bactériennes ont été préparées en utilisant la méthode d'émulsification/gélation interne27 (Fig. 1b). En bref, un mélange de solution d'alginate, de cellules bactériennes et de nanoparticules de CaCO3 a été émulsifié avec de l'alcool isostéarylique (ISA). Les microgouttelettes résultantes ont été gélifiées avec des ions calcium qui ont été libérés des nanoparticules de CaCO3 par l'ajout d'acide acétique à l'émulsion eau-dans-huile. La concentration de cellules bactériennes a été optimisée en utilisant des dilutions en série de sorte qu'une microgouttelette d'alginate contienne une ou aucune cellule bactérienne. Les noyaux de gel d'alginate résultants ont été lavés séquentiellement avec de l'éther diéthylique, du 1-butanol et un tampon Tris – HCl (pH 7, 5).

Une solution d'agarose (SeaPlaque, Lonza; concentration finale 2 %) a ensuite été ajoutée aux noyaux de gel d'alginate en suspension dans du Tris-HCl (pH 7,5) à 35 °C, et le mélange a été émulsifié avec 0,25 % (v/v) de Span 85 dans polyglycéryl-6 octacaprylate (PGO) à 35 ° C (Fig. 1b). Le PGO a été utilisé ici car sa densité est équivalente à l'eau (0,997 g / ml), et donc l'eau émulsionnée de manière stable (Fig. S1a supplémentaire), a empêché l'agrégation du gel d'agarose (S1b) et a augmenté les diamètres (S1c et S1d) et les rendements (S1e) de gouttelettes de gel d'agarose. Les gouttelettes d'agarose ont été progressivement gélifiées dans l'émulsion stable par refroidissement à 4°C. Après élimination du PGO par mélange avec de l'éther diéthylique et ensuite avec du 1-butanol, les noyaux de gel d'alginate ont été solatisés avec un dixième de volume d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 0,5 M. La solation des noyaux d'alginate a été vérifiée en marquant les noyaux d'alginate avec de la rhodamine 123 et en observant la diffusion du colorant dans le tampon lors de la fusion des coquilles de gel d'agarose en présence d'EDTA alors que les noyaux d'alginate sont restés sous forme de gel avec 50 mM CaCl2 (Supplémentaire figure S2). Le noyau de sol d'alginate fournit un espace approprié pour la réaction MDA, ce qui a été démontré par les rendements beaucoup plus élevés d'ADN amplifié que dans les réactions avec un noyau de gel d'alginate ou une perle de gel d'agarose comme décrit ci-dessous. Les AGM ont été lavés avec du tampon Tris – EDTA (TE) (pH 7, 4) pour éliminer l'excès d'EDTA, mis en suspension dans un demi-volume de tampon TE et stockés à 4 ° C. L'ensemble du processus de préparation de l'AGA peut se faire en 7 h.

Escherichia coli DH5α a été utilisé comme micro-organisme modèle. Des cellules d'E. coli ont été ajoutées à une concentration de 3 × 106 cellules mL−1 à une solution d'alginate-CaCO3 et ont été encapsulées dans 5,64 ± 1,72 × 105 AGM (moyenne ± SD) dans trois expériences indépendantes, ce qui correspondait à 12,5 % ± 5,4 % du total des assemblées générales. Parmi les AGM contenant des cellules d'E. coli, environ 94 % abritaient une seule cellule dans le noyau (tableau supplémentaire S1). Dans les trois expériences indépendantes, les diamètres des AGM préparés étaient de 39,6 ± 22,2 µm, 51,4 ± 13,3 µm et 49,3 ± 19,6 µm (Fig. S3a supplémentaire). Les diamètres d'AGM et les volumes de noyau ont montré des distributions normales et des distributions log-normales, respectivement (Figs. Supplémentaires S3b, S4). Le volume central médian moyen d'AGM dans les trois expériences était de 15,1 ± 6,3 pL (n = 3).

Les AGM (en suspension de 50 µL) ont été lavés avec de l'eau stérile et recueillis par centrifugation. La lyse des cellules bactériennes et la dénaturation de l'ADN double brin dans les AGM ont été effectuées à température ambiante pendant 30 min avec 50 µL d'une solution alcaline, qui était le tampon D2 du kit REPLI-g UltraFast Mini (Qiagen). La dénaturation a été arrêtée par neutralisation avec l'ajout d'un volume égal de solution Stop du kit, et le surnageant a ensuite été éliminé par centrifugation. Un tampon de réaction (93,5 µL) contenant 11 µL d'ADN polymérase REPLI-g UltraFast du kit a été ajouté et le mélange résultant a été incubé à 30 °C pendant 3 h. La réaction a été arrêtée avec un dixième de volume d'EDTA 0,5 M et les AGM ont été lavés trois fois avec 200 µL de tampon TE. Tous les réactifs utilisés dans le MDA et la préparation d'AGM ont été irradiés avec de la lumière ultraviolette pour dégrader tout ADN contaminant avant utilisation.

Parmi les 4,6 ± 2,9 × 105 AGM préparés avec des cellules d'E. coli, 8,9 % ± 0,8 % présentaient une amplification de l'ADN, ce qui correspondait à 77,0 % ± 27,2 % des AGM contenant des cellules d'E. coli (n = 3) (tableau supplémentaire S1) . Comme le montre la figure 2, l'ADN amplifié a rempli le noyau de sol d'alginate, tandis que les AGM avec des noyaux de gel d'alginate qui ont été préparés sans l'étape de solation avec de l'EDTA ou des billes de gel d'agarose ne contenant pas de noyau d'alginate ne présentaient qu'une amplification limitée ou nulle de l'ADN par MDA.

Amélioration du rendement de l'amplification par déplacement multiple (MDA) par solation du noyau d'alginate. L'effet de la solation du noyau d'alginate sur la productivité du MDA dans les microcapsules de gel d'agarose (AGM) a été évalué. L'ADN génomique d'Escherichia coli encapsulé dans les AGM a été amplifié par MDA avec ou sans solation d'alginate à l'aide d'EDTA. L'ADN amplifié a été détecté avec SYBR Green I. Une image de contraste de phase (rouge) et une image épifluorescente (vert, SYBR Green I) sont superposées. La MDA dans des billes de gel d'agarose (sans noyau d'alginate), qui a été préparée en utilisant la gélification de gouttelettes d'agarose contenant E. coli dans une émulsion d'huile, a également été menée comme expérience témoin. Les flèches indiquent les cellules E. coli colorées avec SYBR Green I. Bar = 100 µm.

La qualité des génomes amplifiés unicellulaires (SAG) à l'aide de MDA-in-AGM a été évaluée et comparée à celle obtenue par FACS-MDA. Les AGM contenant de l'ADN amplifié qui a été coloré avec du SYBR Green I ont été transférés individuellement dans des tubes PCR de 0,2 mL avec 29 µL d'eau stérile sous un microscope à épifluorescence équipé d'un micromanipulateur TransferMan NK2 (Eppendorf), ce qui a nécessité environ 5 minutes par AGM. Le micromanipulateur a été utilisé dans cette étude en raison de son faible coût initial. Plusieurs dizaines d'AGA sélectionnées ont été séquencées comme suit. L'ADN amplifié dans l'AGM a été libéré dans l'eau en chauffant les tubes à 60 ° C pendant 5 min et directement utilisé pour la préparation de bibliothèques de séquençage à l'aide du kit de bibliothèque d'ADN QIAseq FX (Qiagen). Aucun deuxième cycle de MDA n'a été nécessaire pour obtenir des bibliothèques adaptées au séquençage du génome. Des lectures de séquences appariées ont été générées sur une plate-forme Illumina MiSeq avec le kit de réactifs V3 (600 cycles), et un nombre fixe de paires de lectures ont été choisies au hasard et assemblées de novo en contigs à l'aide de SPAdes 3.13.028 après un filtrage de qualité standard. Les contigs > 1 kb ont été utilisés pour les analyses ultérieures. Plusieurs facteurs décrivant la qualité de la séquence du génome, y compris l'exhaustivité et le taux de contamination, ont été évalués à l'aide de CheckM29 et QUAST30 et comparés entre les SAG obtenus à l'aide de MDA-in-AGM et de FACS-MDA.

L'exhaustivité du génome et la longueur totale de la séquence des SAG d'E. coli obtenus par MDA-in-AGM ont rapidement augmenté au cours de l'effort de séquençage, et l'exhaustivité moyenne du génome a atteint 93,3 % ± 4,1 % (n = 10) pour les assemblages utilisant une couverture de 60 fois , alors qu'il était de 33,7 % ± 17,3 % (n = 10) dans le FACS-MDA (test t de Student, P < 0,01) (Fig. 3a, Tableau supplémentaire S2). Le génome couvert calculé en cartographiant les lectures sur la séquence du génome de référence E. coli DH5α (BOCF01000000) était de 97,4 ± 2,1 % dans MDA-in-AGM (n = 10), ce qui était bien supérieur à 47,8 % ± 13,5 % dans FACS-MDA (n = 10) pour une couverture de 60 fois (P < 0,01) (tableau supplémentaire S2). La forte diminution du nombre de contigs, c'est-à-dire l'assemblage en douceur des contigs, dans MDA-in-AGM le long de la profondeur de l'effort de séquençage était probablement due au biais d'amplification plus faible (Fig. 3a). De plus, le biais d'amplification entre les régions du génome, qui est inhérent au MDA, était bien amélioré dans le MDA-in-AGM par rapport au FACS-MDA (Fig. 3b). Le biais d'amplification des SAG a ensuite été évalué à l'aide des coefficients de Gini et des courbes de Lorenz, qui indiquent la disparité de la population sous forme d'indices et de graphiques. Les coef .S5a). Dans la courbe de Lorenz, les SAG obtenus par MDA-in-AGM ont montré une uniformité d'amplification plus élevée que ceux obtenus par FACS-MDA (Fig. S5b supplémentaire). D'autres mesures de qualité des SAG utilisant toutes les lectures de séquence sont présentées dans le tableau supplémentaire S3.

Comparaison de l'exhaustivité du génome et du biais d'amplification des génomes unicellulaires obtenus par MDA-in-AGM et FACS-MDA. (a) Complétude et nombre de contigs de SAG pendant le processus de séquençage. Des parcelles de boîte et de violon (bleu : MDA-in-AGM ; rouge : FACS-MDA) sont présentées pour Escherichia coli et deux espèces bactériennes à titre d'exemples de la communauté fictive de bactéries intestinales humaines (tableaux supplémentaires S2, S5 et S6). Les points de données (cercles violets) et leurs moyennes arithmétiques (losanges) sont indiqués sur les graphiques. Dans les graphiques E. coli, les résultats pour l'ADN préparé à partir de cellules E. coli cultivées sans MDA sont également indiqués (cercles verts). Dans les panneaux de gauche, les différences significatives sont indiquées par des astérisques (P < 0,05) ou des doubles astérisques (P < 0,01). (b) Le nombre de lectures de séquences cartographiées par rapport aux régions du génome est présenté comme un indicateur du biais d'amplification causé pendant la MDA. Le nombre de lectures correspondant aux différentes couvertures utilisées pour l'assemblage de novo (indiqué par « Cov. ») et l'exhaustivité du génome (%) (« Compl. ») Estimée à l'aide de CheckM est indiquée.

Pour évaluer la faisabilité de MDA-in-AGM dans un échantillon plus réaliste, nous avons construit une communauté fictive comprenant 15 souches cultivées de bactéries intestinales humaines. La taxonomie et les compositions de chaque souche bactérienne estimées à l'aide d'une analyse d'amplicon d'ARNr 16S ou d'une analyse de métagénome sont présentées dans le tableau supplémentaire S4. Les SAG de la communauté fictive ont été obtenus en utilisant soit MDA-in-AGM soit FACS-MDA de la même manière que ci-dessus. Les compositions taxonomiques des SAG étaient similaires entre MDA-in-AGM et FACS-MDA, qui ont tous deux récupéré avec succès les SAG de la plupart des souches représentant> 5% de la communauté fictive à l'exception de Faecalibacterium prausnitzii (tableau supplémentaire S4). Par exemple, les SAG de Bacteroides thetaiotaomicron et Parabacteroides distasonis présentaient des différences claires entre MDA-in-AGM et FACS-MDA en termes de complétude du génome, de nombre de contigs et de biais d'amplification, comme on le voit dans les SAG d'E. coli (Fig. 3, Fig. .S5). Étant donné que de nombreux SAG obtenus à partir d'échantillons environnementaux étaient difficiles à comparer à la même couverture en raison de l'absence de leurs génomes de référence, les faux SAG ont été assemblés à l'aide de paires de lecture de 0, 3 M dans les expériences suivantes. La complétude globale du génome des SAG avec < 5 % de contamination était significativement plus élevée dans MDA-in-AGM (68,0 % ± 23,3 %, n = 39) que dans FACS-MDA (42,4 % ± 20,5 %, n = 36) (P < 0,01) (tableaux supplémentaires S5, S6). Les SAG de la plupart des autres souches ont également montré des résultats similaires à ceux d'E. coli (Fig. S6 supplémentaire).

La plupart des lectures de séquences ont été cartographiées sur leurs génomes de référence respectifs : les taux de cartographie médians étaient de 95,1 % et 97,6 % pour les SAG de MDA-in-AGM et FACS-MDA, respectivement (tableau supplémentaire S7). Bien que les taux de contamination croisée aient été légèrement plus élevés dans le MDA-in-AGM que dans le FACS-MDA, les deux étaient inférieurs à 5 % (tableau supplémentaire S7). À Ba. thetaiotaomicron SAGs, la séquence se lit à partir d'un Ba. le plasmide taiotaomicron a également été obtenu (tableau supplémentaire S7). Nos résultats ont indiqué que le MDA-in-AGM est applicable à diverses espèces bactériennes et améliore l'exhaustivité du génome des bactéries Gram-positives et Gram-négatives, quelle que soit leur teneur en GC (Fig. 4). Pour Fa. prausnitzii, il est possible que le processus de lyse cellulaire utilisant KOH n'ait pas été efficace, et donc aucun SAG n'a été obtenu dans MDA-in-AGM ou FACS-MDA.

Relations entre l'exhaustivité du génome et le contenu en GC des génomes unicellulaires dans la communauté fictive des bactéries intestinales humaines. Les génomes amplifiés à cellule unique (SAG) de la communauté fictive comprenant 15 souches de bactéries intestinales humaines sont tracés avec leur contenu en GC par rapport à l'exhaustivité de leur génome. Les SAG ont été assemblés à partir de 0,3 M de paires de lecture choisies au hasard, tandis que MS485-1-51 de MDA-in-AGM (0,26 M de paires de lecture) et CS1–94 de FACS-MDA (0,29 M de paires de lecture) ont utilisé toutes les paires de lecture car elles étaient inférieures à 0,3 M. Les espèces bactériennes composant la communauté fictive et les résultats détaillés sont présentés dans les tableaux supplémentaires S4 à S6. Le bleu et le rouge indiquent respectivement MDA-in-AGM et FACS-MDA. Les carrés, les cercles et les losanges indiquent respectivement les bactéries gram-positives, gram-négatives et gram-variables.

Les SAG de MDA-in-AGM avec> 5% de contamination, qui seraient causées soit par la contamination de l'ADN extracellulaire, soit par l'encapsulation de plusieurs cellules dans un seul AGM, ont été regroupés dans chaque espèce bactérienne à l'aide de metaWRAP31, bien que la discrimination entre l'ADN contaminant et l'ADN de capturé plusieurs cellules était difficile. En conséquence, 30 SAG supplémentaires avec <5% de contamination ont été obtenus, et leurs taux d'exhaustivité et de contamination du génome étaient de 73,5% (médiane) et de 0,9% (médiane), respectivement (tableau supplémentaire S8).

Le réarrangement de l'ADN au cours de la MDA, c'est-à-dire la formation de chimères, peut compliquer l'assemblage de novo de génomes unicellulaires32. Dans les SAG d'E. coli, les taux de lectures chimériques étaient légèrement plus élevés dans les MDA-in-AGM (6,28 % ± 1,09 %) que dans les FACS-MDA (4,49 % ± 1,32 %) (test t de Welch, P < 0,01 ; Tableau supplémentaire S3). Dans les SAG de la communauté fictive, les taux de lectures chimériques étaient plus élevés dans MDA-in-AGM (8,22 % ± 2,28 %) que dans FACS-MDA (3,55 % ± 1,07 %) (test t de Welch, P < 0,01 ; Tableaux supplémentaires S5, S6). Ces taux de lectures chimériques dans MDA-in-AGM étaient similaires ou légèrement supérieurs au taux de 6,19 % dans une étude précédente utilisant une méthode MDA conventionnelle pour le séquençage des génomes haploïdes humains33.

Enfin, nous avons appliqué MDA-in-AGM à un échantillon environnemental naturel. Nous avons utilisé le microbiote de l'intestin du termite Reticulitermes speratus, qui comprend plusieurs centaines d'espèces bactériennes de divers phyla34. Le microbiote intestinal des termites a attiré les chercheurs en particulier pour le système symbiotique complexe permettant la dégradation très efficace de la biomasse végétale35,36,37. Le microbiote intestinal des termites est également supérieur pour une étude comparative utilisant un échantillon environnemental naturel car sa structure de communauté bactérienne est très cohérente au sein d'une espèce de termite et a été bien caractérisée34,36,38,39 et, en outre, les séquences complètes du génome des espèces dominantes. des espèces bactériennes dans les intestins de R. speratus ont été signalées40,41,42.

Les entrailles entières de cinq termites ouvrières ont été retirées et le contenu des intestins a été suspendu. Ensuite, les cellules bactériennes ont été collectées à 18 000 x g pendant 5 min par centrifugation après digestion de l'ADN extracellulaire avec la DNase I, et les cellules ont été lavées avec de l'eau stérile comme décrit précédemment43. Les procédures ultérieures étaient les mêmes que celles décrites ci-dessus. Pour évaluer MDA-in-AGM à l'aide d'échantillons environnementaux provenant des tripes de termites, nous avons analysé 48 SAG obtenus par MDA-in-AGM. Les SAG ont montré une complétude génomique élevée (78,6 % ± 18,2 %) et un faible taux de contamination (1,0 % ± 1,0 %) (tableau 1). Les SAG ont été classés taxonomiquement à l'aide du Genome Taxonomy Database Tool Kit (GTDB-Tk)44 et ont été affiliés à 13 classes bactériennes, y compris des groupes dominants connus dans l'intestin des termites, Spirochaetia, Bacteroidia, Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Epsilonproteobacteria et Clostridia34,38 . En revanche, l'exhaustivité du génome des SAG obtenus par FACS-MDA n'était que de 37,7 % ± 19,0 % (n = 161). Bien qu'une méthode de séquençage différente, c'est-à-dire une combinaison du kit de préparation de bibliothèque d'ADN Nextera XT (Illumina) et de la plate-forme Illumina HiSeq 2500 (500 cycles), ait été utilisée pour ce dernier cas, le nombre de lectures (bases) utilisées pour l'assemblage était beaucoup plus grand en moyenne (551 Mb ± 64 Mb, n = 161) que dans l'analyse des SAG obtenus par MDA-in-AGM (256 Mb ± 49 Mb, n = 48) (tableau supplémentaire S9).

En plus des 48 SAG, nous avons analysé 18 SAG de la classe Endomicrobia avec de petites tailles de génome (~ 1 Mb) 40 obtenus par MDA-in-AGM, et une complétude du génome de 91, 2% ± 9, 8% a été obtenue. De plus, parmi eux, huit SAG de phylotype Rs-D17 ont été comparés aux séquences complètes du génome obtenues précédemment40,41. Les couvertures génomiques calculées par cartographie des lectures sur les deux génomovars de Rs-D17 (Ri200840 et Ti200541) ont atteint respectivement 95,7 % ± 1,3 % et 96,7 % ± 0,9 % (tableau supplémentaire S10). La composition de la communauté intestinale des termites a été estimée à partir des SAG obtenus par analyse d'amplicon MDA-in-AGM ou ARNr 16S (tableau supplémentaire S11). La composition taxonomique des SAG a montré une corrélation positive élevée (R = 0, 834, P < 0, 01; coefficient de corrélation de Pearson) avec celle montrée par l'analyse de l'amplicon d'ARNr 16S, alors que les fréquences des bactéries gram-positives étaient plus faibles dans les SAG.

MDA-in-AGM, qui consistait en MDA massivement parallèles dans les noyaux AGM à l'échelle du picolitre, a considérablement amélioré l'exhaustivité du génome des SAG d'E. coli, une communauté fictive de bactéries intestinales humaines, et de bactéries dans l'intestin des termites, par rapport aux échelle du microlitre FACS-MDA. Parmi eux, les SAG à couverture élevée obtenus à partir des bactéries intestinales des termites à l'aide de MDA-in-AGM (tableau 1, tableau supplémentaire S9) inciteront à comprendre le système symbiotique intestinal complexe et les mécanismes du système très efficace de décomposition de la lignocellulose34, 36,40,41,43. Ainsi, cette méthode peut révéler la capacité métabolique des procaryotes encore non cultivés dans des environnements tels que le tractus intestinal des animaux, le sol et l'hydrosphère.

L'amélioration de l'exhaustivité du génome dans la génomique unicellulaire en réduisant le volume de réaction de MDA à l'aide de techniques de microfabrication a déjà été rapportée10,15,17,20,45, et les comparaisons de MDA-in-AGM avec ces autres méthodes MDA sont présentées dans Tableau supplémentaire S12. Bien que l'exhaustivité élevée du génome soit également obtenue à l'aide d'autres méthodes MDA miniaturisées, MDA-in-AGM ne nécessite pas d'équipement spécialisé et fournit une préparation d'échantillons évolutive. De plus, l'utilisation d'un noyau de sol d'alginate a amélioré avec succès le rendement de MDA, conduisant à l'élimination d'une étape MDA de deuxième tour et conduisant ainsi à moins de biais d'amplification et à un flux de travail plus simple. Ce rendement élevé est probablement attribuable à la diffusivité accrue de l'ADN amplifié dans le sol core46. Notre MDA-in-AGM est applicable aux bactéries gram-positives et gram-négatives ainsi qu'aux génomes à forte teneur en GC (Fig. 4). Les avantages supplémentaires de l'AGM sont sa stabilité physique et sa perméabilité aux petites molécules, ce qui facilite l'échange de tampon et la manipulation physique de la bouillie.

La formation de séquences chimériques au cours de la MDA peut affecter l'efficacité et la précision de l'assemblage de novo des SAG47. Dans la communauté fictive, les taux de lectures chimériques étaient comparables à ceux des gouttelettes MDA19 et légèrement supérieurs à ceux des méthodes MDA conventionnelles (tableau supplémentaire S12)33. Étant donné que la formation de chimères est probablement attribuable à la migration des branches de l'ADN amplifié32, une température de réaction MDA plus élevée en utilisant l'ADN polymérase phi29 thermostable14 peut réduire l'hybridation erronée entre les réplicons.

L'uniformité des tailles de noyau d'alginate, qui correspondent aux volumes de réaction MDA (tableau supplémentaire S1), peut avoir affecté les rendements d'AGM amplifié par ADN, l'uniformité des quantités de produits MDA et la qualité des bibliothèques AGM. Bien que des noyaux d'alginate de < 100 µm de diamètre aient été utilisés pour les préparations d'AGM, une sélection de taille plus étroite des noyaux d'alginate, par exemple de 20 à 40 µm de diamètre, améliorerait l'uniformité des noyaux d'AGM. L'extrusion48 et les microcanaux17,18,19 amélioreraient également l'uniformité du noyau AGM sans sélection de taille. Cependant, l'introduction de ces processus compliquera le flux de travail et augmentera le coût.

La procédure de cueillette manuelle à l'aide d'un micromanipulateur est l'étape limitant le débit dans la génomique unicellulaire utilisant MDA-in-AGM. Pour augmenter le débit, le tri AGM utilisant le FACS ou le codage à barres moléculaire49 des SAG peut être adapté, bien que ces approches réduisent également la simplicité et le coût peu élevé du protocole actuel.

La composition taxonomique des SAG obtenus par MDA-in-AGM était largement cohérente avec celles montrées par l'amplicon d'ARNr 16S et les analyses métagénomiques ; cependant, un SAG du Fa dominant. prausnitzii n'a été récupéré ni dans MDA-in-AGM ni dans FACS-MDA (tableau supplémentaire S4). Ainsi, cet échec n'était pas spécifique à MDA-in-AGM mais était attribuable à la procédure MDA. Des écarts similaires dans la composition taxonomique ont été trouvés dans les classes bactériennes à Gram positif dans des expériences utilisant le microbiote intestinal des termites (tableau supplémentaire S11), de sorte qu'une modification de la procédure de lyse cellulaire, y compris l'ajout de lysozyme, peut être nécessaire pour certaines bactéries à Gram positif. Bien que nous n'ayons pas encore tenté, le lysozyme d'une taille de 4 nm50 diffusera à travers une coquille de gel d'agarose composée de 2 % d'agarose à bas point de fusion (taille des pores de 200 nm)51 et lysera la paroi cellulaire bactérienne dans le noyau. Pour optimiser de telles conditions, l'AGM est également supérieure car l'échange de la solution est plus facile par rapport aux autres méthodes.

La complétude moyenne inférieure du génome de la communauté factice (68 %) et du microbiome intestinal des termites (79 %) par rapport à celle d'E. coli (93 %) (tableaux supplémentaires S2, S5, tableau 1) peut être due aux différences de la facilité de lyse cellulaire. La faible complétude du génome des SAG dans certaines lignées bactériennes et certains échantillons environnementaux, par rapport aux SAG d'E. coli en culture, a été rapportée dans des études antérieures, quelles que soient les méthodes de MDA1,52. Par exemple, dans le MDA unicellulaire en gouttelettes, l'exhaustivité du génome d'E. coli et du microbiote du sol a été trouvée à 96,5 % ± 2,2 % (n = 16) et 52,8 % ± 24,3 % (n = 17), respectivement19. L'optimisation de la lyse cellulaire pour différentes souches procaryotes et échantillons environnementaux est également importante pour augmenter l'exhaustivité du génome.

Récemment, alors que nos expériences étaient en cours, un rapport a été publié qui montre que le MDA utilise une microcapsule d'hydrogel à noyau creux constituée d'une enveloppe de gel de PEG réticulé et d'un noyau de sol de dextrane, une structure de capsule similaire à l'AGM46. Bien que le biais d'amplification n'ait pas été évalué, le MDA unicellulaire dans le noyau augmente la quantité de produit MDA par rapport au MDA dans la perle de gel. De plus, la coque d'une microcapsule d'hydrogel à noyau creux empêche l'ADN génomique de fuir du noyau après dénaturation alcaline avant MDA. Cependant, la lumière proche ultraviolette (365 nm) utilisée pour la réticulation photochimique de la coque du PEG endommage les cellules et l'ADN en raison de la photooxydation53. Nous avons sélectionné l'agarose comme coque AGM car elle permet une gélification réversible thermiquement douce, est disponible dans le commerce et est stable en présence de réactifs MDA, en particulier de solution alcaline, de tampon de neutralisation et d'EDTA.

Les AGM ou autres chambres de réaction contenant des cellules bactériennes uniques produisent inévitablement une proportion de chambres contenant plusieurs cellules bactériennes21, et il est difficile d'éliminer complètement l'ADN contaminant dans nos procédures expérimentales, comme dans d'autres méthodes développées précédemment1. Néanmoins, l'application d'un programme informatique de regroupement de fragments métagénomiques, tel que metaWRAP31, nous a permis de récupérer un nombre considérable de SAG au moins de qualité médiane à partir de mini-bacs métagénomes résultant de plusieurs cellules en éliminant les séquences contaminantes (tableau supplémentaire S8) .

Ces dernières années, de nombreuses études analysant des génomes assemblés par métagénome à partir d'échantillons environnementaux ont été rapportées54. Bien que la génomique unicellulaire présente différents avantages et augmente potentiellement la qualité de la recherche en combinaison avec la métagénomique, par exemple, en révélant l'hétérogénéité au niveau des souches55 et en fournissant des informations sur les composants génétiques transférés horizontalement45, elle est difficile à réaliser pour de nombreux microbiologistes. MDA-in-AGM est une méthode beaucoup plus facile et moins coûteuse de génomique unicellulaire, et en plus, seule une petite quantité d'échantillon est nécessaire. Ainsi, cette méthode convient également aux petits spécimens, tels que le tractus intestinal des petits insectes et des cellules protistes avec des communautés bactériennes endo- et ecto-symbiotiques.

De l'eau distillée ultra pure sans DNase/RNase (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a été utilisée pour toutes les solutions préparées en interne. Les solutions ont été autoclavées à 121°C pendant 15 min et ensuite décontaminées par un rayonnement UV à 7,2 mW/cm2 pendant une nuit (12 h) dans une hotte à flux laminaire.

Une suspension de nanoparticules uniformes de CaCO3 (9,4 % p/v, diamètre 100 nm, pH 10) a été fournie par Shiraishi Central Laboratories (Hyogo, Japon). La conductivité et le pH de la suspension de CaCO3 ont été réduits en lavant les particules avec trois volumes d'eau. En plus du CaCO3 de Shiraishi, du carbonate de calcium fin tel que le carbonate de calcium précipité BioUltra (diamètre d'environ 3 µm ; Sigma, St. Louis, MO) a également été utilisé pour la gélification du noyau d'alginate. Une solution d'alginate (5 %, p/v) a été préparée en dissolvant de l'alginate de sodium (80–120 cP à 1 %, p/v ; Wako, Osaka, Japon) dans de l'eau et stockée à 4 °C. La solution d'agarose a été préparée en dissolvant SeaPlaque (2 % final, p/v ; Lonza, Bâle, Suisse) dans de l'eau et stockée à 4 °C. Le polyglycéryl-6 octacaprylate (PGO ; Nisshin Oillio, Tokyo, Japon), le tampon Tris-EDTA (TE ; BioUltra pour la biologie moléculaire, pH 7,4 ; Sigma) et le kit REPLI-g UltraFast Mini (Qiagen, Hilden, Allemagne) ont été utilisés comme décrit ci-dessous.

Après qu'une solution d'agarose (2 mL) a été mélangée avec du PGO ou de l'ISA, chacun contenant 0,25 % de monooléate de sorbitan (Span 85 ; Wako) (v/v) (20 mL, 35 °C), par vortex et gélifié sur de la glace, des billes d'agarose ont été récupérés à partir de PGO ou ISA comme décrit ci-dessous. Les gros agrégats d'agarose ont été retirés des billes d'agarose à l'aide de tamis cellulaires de 300 µm (pluriSelect, Leipzig, Allemagne). Les billes d'agarose ont été observées au microscope à fluorescence inversé (IX71 ; Olympus, Tokyo, Japon) équipé d'une caméra CCD (BU-51LN ; Bitran, Saitama, Japon). Les diamètres des billes d'agarose sur un pixel sur les images (1,28 µm) ont été mesurés avec ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Les rendements et les diamètres des billes d'agarose ont été analysés statistiquement avec R (https://www.r-project.org/).

Escherichia coli DH5α (TaKaRa Bio Inc., Shiga, Japon) d'une seule colonie sur une plaque LB a été cultivée dans deux flacons avec du milieu LB (200 ml). Les cellules d'E. coli ont ensuite été récoltées et lavées deux fois dans du PBS (20 mL) par centrifugation. Les cellules ont été remises en suspension dans du PBS (10 ml) et leur densité a été déterminée avec une chambre de comptage de cellules. Les cellules d'E. coli (3,05 × 1010 cellules/mL) ont été divisées en aliquotes dans des microtubes (0,5 mL chacun) et stockées à - 80 °C. Comme mentionné ci-dessous, des cellules individuelles d'E. coli, l'échantillon factice et le microbiome intestinal des termites ont été analysés à l'aide de cellules stockées à - 80 ° C, d'un mélange de stocks de glycérol stockés à - 80 ° C et d'échantillons vivants d'intestins de termites, respectivement.

Les cellules d'Escherichia coli ont été encapsulées dans des noyaux d'alginate par la méthode d'émulsification/gélation interne27 (Fig. 1b). Les cellules E. coli de la culture mère (10 µL) ont été mélangées avec 990 µL de solution d'alginate de sodium à 2 % contenant 1 % de CaCO3 et 50 mM de tampon acétate (pH 7,0, Sigma). Le mélange a été émulsifié avec 9 ml d'alcool isostéarylique (ISA; Kokyu Alcohol Kogyo Co., Ltd., Chiba, Japon) contenant 3% de lécithine (Wako) dans un tube de 50 ml par vortex pendant 1 min. L'émulsion a été mélangée avec de l'acide acétique à 2 % dans de l'ISA (0,1 ml chacun) en vortexant dix fois pendant 1 min chacun. Au cours de cette procédure, le pH du mélange a progressivement diminué jusqu'à 4,0 et les nanoparticules de CaCO3 ont été dissoutes. Les ions calcium libérés du CaCO3 ont gélifié les microgouttelettes d'alginate dans l'émulsion. L'ISA a été éliminé en mélangeant avec 9 ml d'éther diéthylique et en centrifugeant à 4 ° C pendant 3 min à l'aide d'un rotor oscillant (3000 × g, 5702R, Eppendorf, Hambourg, Allemagne). L'ISA résiduel a ensuite été éliminé des noyaux d'alginate en mélangeant avec du tampon Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contenant 0,2 % (v/v) de Tween 20 (Tris-Tween 20) (5 ml), suivi d'une centrifugation, puis en répétant la procédure deux fois avec du 1-butanol (5 mL). Les noyaux d'alginate résultants ont été suspendus dans un volume de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) et filtrés à travers un tamis cellulaire de 100 µm (pluriSelect) pour éliminer les gros agrégats d'alginate. Les noyaux d'alginate filtrés ont ensuite été lavés avec du Tris-HCl (pH 7,5) et collectés dans des microtubes de 2 ml. Le volume des noyaux d'alginate a été calculé à partir de son poids et stocké à 4 ° C après mélange avec un demi-volume de Tris-HCl (pH 7,5). Pour ajuster le nombre de cellules E. coli dans un seul noyau d'alginate à moins de deux, 10 µL de 3,05 × 106–108 cellules E. coli du stock d'E. coli ont été mélangés avec 990 µL de la suspension d'alginate contenant du CaCO3. Une fois que les noyaux d'alginate contenant E. coli ont été préparés à partir du mélange, E. coli dans les noyaux d'alginate a été observé à l'aide de SYBR Green I (TaKaRa Bio Inc.) (Fig. S7 supplémentaire). À 3,05 × 106 cellules/mL du mélange d'alginate, 17,6 % des noyaux contenaient E. coli et 78,8 % de ceux portaient des cellules individuelles. Ainsi, 3,05 × 106 cellules/mL d'E. coli ont été utilisées pour la préparation du noyau d'alginate dans les expériences ultérieures.

Le surnageant de la suspension de noyau d'alginate (600 µL) a été éliminé après centrifugation dans un tube de 50 mL. Les noyaux d'alginate résiduels (400 µL) ont été mélangés avec la solution d'agarose telle que préparée ci-dessus (2 mL). Le mélange a été émulsifié avec 0, 25% (v / v) Span 85 dans du PGO (20 ml) au vortex pendant 1 min (Fig. 1b). Les noyaux d'alginate, la solution d'agarose et le PGO ont été préincubés à 35 ° C pendant 10 min pour empêcher la formation de gros agrégats d'agarose gélifiés. Ensuite, l'agarose a été gélifié par refroidissement sur glace pendant 1 h. Le PGO a été éliminé de l'émulsion par lavage comme décrit ci-dessus. Le noyau de gel d'alginate a été solatisé en chélatant les ions calcium avec l'ajout d'un volume de 1/10 d'EDTA 0,5 M (Thermo Fisher Scientific). Les AGM ont ensuite été mis en suspension dans un volume de tampon TE. Les gros débris de la suspension ont été éliminés à travers un tamis cellulaire de 300 µm et les AGM ont été lavés davantage avec du TE. Les AGM ont été dilués dans du Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) contenant 0,5 % d'agarose SeaPlaque, 0,1 % de p-phénylène diamine (Wako) et du SYBR Green I dilué 10 000 fois (TaKaRa Bio Inc.), et la morphologie, la densité , le diamètre et le nombre de cellules E. coli encapsulées ont été observés comme mentionné ci-dessus. Les AGM ont été conservés à 4 °C. Pour un stockage à long terme (plus d'une semaine), les AGM ont été stockés dans de l'éthanol à 40 % à - 80 °C et lavés trois fois dans dix volumes d'eau avant utilisation. La qualité de l'ADN génomique des AGM stockés dans EtOH à 40% a été confirmée via leur amplification à l'aide de MDA.

Des noyaux de gel d'alginate sans E. coli ont été marqués avec de la rhodamine 123 (Wako) en utilisant du chlorhydrate de 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd., TCI, Tokyo, Japon) et du N-hydroxysuccinimide ( Wako)56. Les AGM contenant des noyaux marqués à la rhodamine 123 ont été chauffés à 65 ° C pendant 5 min en présence d'EDTA 50 mM ou de CaCl2 50 mM. Des noyaux résiduels ont été observés comme mentionné ci-dessus.

Des aliquotes (50 µL) des AGM contenant des cellules E. coli avant la solation des noyaux d'alginate ont été mélangées avec un volume de solution de lyse cellulaire contenant 400 mM de KOH avec ou sans 10 mM d'EDTA et elles ont été neutralisées avec 100 µL de tampon d'arrêt du Mini kit REPLI-g UltraFast. Les AGM contenant E. coli, les AGM sans E. coli (témoin négatif) et les billes d'agarose contenant E. coli (témoin) ont été soumis à la MDA comme décrit ci-dessous, et leurs ADN amplifiés ont été observés.

Une aliquote de 50 µL d'AGM a été centrifugée et les AGM collectées ont été lavées avec 200 µL d'eau. La lyse cellulaire et la dénaturation de l'ADN ont été réalisées avec le tampon D2 (50 µL) du kit REPLI-g UltraFast Mini à température ambiante pendant 30 min. Après l'arrêt de la dénaturation avec le tampon Stop (50 µL), le surnageant a été éliminé par centrifugation. Le tampon de réaction (93,5 µL) contenant 11 µL d'ADN polymérase phi29 du kit a été ajouté et incubé à 30 °C pendant 3 h (MDA-in-AGM). La réaction a été arrêtée avec 1/10 de volume d'EDTA 0,5 M et les AGM ont été lavés trois fois avec 200 µL de tampon TE. Les AGM lavés ont été conservés à 4 °C.

Le MDA à cellule unique utilisant un trieur de cellules activé par fluorescence MoFlo XDP (Beckman Coulter Inc., Brea, CA) a été réalisé comme contrôle43. Après E. coli, la communauté bactérienne fictive et les bactéries intestinales des termites ont été colorées avec SYBR Green I ou CellTracker Green (Thermo Fisher Scientific), et les bactéries colorées ont été triées en une seule cellule par puits de plaques PCR à 96 puits. La lyse cellulaire a été réalisée avec le tampon D2 (1,5 µL) du kit REPLI-g UltraFast Mini à température ambiante pendant 30 min. Après l'arrêt de la dénaturation avec le tampon d'arrêt (1,5 µL), le tampon de réaction (7,5 µL) contenant 0,5 µL d'ADN polymérase phi29 du kit a été ajouté et incubé à 30 °C pendant 3 h et à 65 °C pendant 15 min. Pour vérifier l'amplification du génome et le degré de contamination, les produits MDA ont été évalués par séquençage Sanger direct de l'ARNr 16S. La PCR a été réalisée avec des amorces de gène d'ARNr 16S universel Bacteria : 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) et 1390R (5'-ACGGGCGGTGTGTACAA).

Une communauté fictive de bactéries intestinales humaines a été préparée à l'aide de 15 isolats (tableau supplémentaire S4) obtenus auprès de la Japan Collection of Microorganisms. Un mélange de tous les stocks de glycérol en quantités égales a été utilisé comme communauté bactérienne fictive. Après que la communauté bactérienne fictive a été diluée 100 fois avec de l'eau, le diluant (10 µL) a été traité avec de la DNase I (20 µL) à 30 °C pendant 30 min. Les cellules ont été lavées trois fois par mise en suspension dans de l'eau (1 mL), recueillies par centrifugation à 18 000 xg pendant 5 min et mises en suspension dans de l'eau (10 µL). Après le MDA-in-AGM comme décrit ci-dessus, les AGM ont été observés avec SYBR Green I à l'aide d'un microscope. Parmi le grand nombre d'AGM dans le champ de vision microscopique, seuls quelques AGM contenaient des ADN amplifiés, qui ont été isolés à l'aide d'un micromanipulateur comme décrit ci-dessous.

Pour déterminer la composition de la communauté bactérienne fictive, l'ADN total a été extrait à l'aide du kit DNeasy Ultra Clean Microbial (Qiagen). Le séquençage du métagénome a été réalisé en préparant une bibliothèque avec le kit de bibliothèque d'ADN QIAseq FX (Qiagen). Le séquençage des amplicons des gènes d'ARNr 16S dans la communauté fictive a également été réalisé en préparant une bibliothèque avec les indices Nextera XT Index Kit 96 (Illumina, Inc., San Diego, CA) et la plateforme MiSeq avec Reagent Kit V3 (600 cycles). La composition bactérienne de la communauté fictive a été estimée sur la base des résultats analysés dans QIIME257.

Des spécimens du termite mangeur de bois Reticulitermes speratus ont été collectés à Tsukuba dans la préfecture d'Ibaraki, au Japon. Les entrailles de cinq termites ouvrières ont été retirées et le contenu de l'intestin a été mis en suspension dans une solution U58, qui consistait en 9,2 mM de NaHCO3, 5,1 mM de citrate trisodique dihydraté, 13 mM de KH2PO4, 37 mM de NaCl, 0,75 mM de CaCl2 et 0,4 mM de MgSO4. L'ADN extracellulaire et l'ADN protiste ont été digérés à l'aide de la DNase I, et les cellules bactériennes ont été collectées à 18 000 × g pendant 5 min par centrifugation et lavées à l'eau comme mentionné ci-dessus43. Les bactéries intestinales de termites lavées ont été mises en suspension dans de l'eau (10 µL). La MDA-in-AGM pour les bactéries intestinales des termites a été réalisée en utilisant la suspension comme communauté fictive.

Les AGM contenant de l'ADN amplifié, détectés avec SYBR Green I, ont été transférés individuellement dans des tubes PCR sous un microscope à fluorescence inversé équipé d'un micromanipulateur (TransferMan NK2; Eppendorf, Hambourg, Allemagne). De l'eau (29 µL) a été ajoutée à chaque tube PCR avec un seul AGM et incubée à 60 °C pendant 5 min pour libérer l'ADN en solatisant la coquille d'agarose. Pour vérifier le degré de contamination, nous avons criblé les produits MDA-in-AGM par séquençage direct Sanger du gène ARNr 16S comme mentionné ci-dessus. Après avoir retiré les échantillons contaminés, des bibliothèques de séquençage ont été préparées à l'aide du kit de bibliothèque d'ADN QIAseq FX. Étant donné que les produits MDA dans les noyaux AGM étaient trop petits pour être quantifiés, les temps de fragmentation et de ligature dans la construction de la bibliothèque ont été effectués en utilisant une condition d'ADN d'entrée <10 ng dans les instructions du fabricant. Le séquençage du génome a été réalisé sur la plateforme MiSeq avec le Reagent Kit V3 (600 cycles). Des bibliothèques de séquences pour des cellules individuelles isolées du microbiote intestinal des termites à l'aide de FACS ont été préparées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN Nextera XT (Illumina) et analysées sur la plate-forme Illumina HiSeq 2500 (500 cycles).

Les lectures courtes générées ont été découpées à l'aide de Cutadapt (https://github.com/marcelm/cutadapt), PRINSEQ (http://prinseq.sourceforge.net/), FASTX Trimmer, FASTQ Quality Trimmer (http://hannonlab.cshl .edu/fastx_toolkit/download.html) et cmpfastq_pe (http://compbio.brc.iop.kcl.ac.uk/software/download/cmpfastq_pe). Les lectures coupées ont été assemblées à l'aide de SPAdes ver. 3.13.0 (k-mer : 21, 33, 55, 77, 99 et 127, options : -sc, -attention)28 en contigs. Seuls les contigs > 1 kb ont été sélectionnés à l'aide du SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) pour les analyses ultérieures.

La classification taxonomique des génomes unicellulaires d'échantillons d'intestins de termites a été réalisée à l'aide du kit d'outils de base de données de taxonomie du génome (GTDB-Tk)44. Les données de séquence génomique montrant > 5 % de contamination, identifiées à l'aide de CheckM29, ont été séquentiellement soumises à des processus de regroupement, de raffinement et de réassemblage avec les modules BINNING (y compris metaBAT259, MaxBin260 et CONCOCT61), BIN_REFINEMENT et REASSEMBLE_BINS de metaWRAP31.

Pour les analyses de génome unicellulaire utilisant E. coli DH5α et des bactéries intestinales humaines avec une couverture croissante (Fig. 3), les lectures ajustées par adaptateur à l'aide de Trimmomatic62 ont été choisies au hasard à l'aide de Rasusa63 et assemblées de novo à l'aide de SPAdes28. L'exhaustivité du génome et le nombre de contigs dans les assemblages ont été évalués à l'aide de CheckM29 et tracés à l'aide de R. Les lectures de séquençage correspondant à différentes couvertures ont été cartographiées sur des séquences génomiques connues à l'aide de Bowtie264, et les résultats ont été visualisés sous forme de cartes thermiques à l'aide d'IGV ver. 2.3.26 (http://software.broadinstitute.org/software/igv/). Le génome couvert (%), qui était les régions du génome couvertes avec au moins une lecture par 1 kb-bin, a été calculé à l'aide de BBtools (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/).

Les biais d'amplification des SAG ont été évalués à l'aide des coefficients de Gini et des courbes de Lorenz. Après que les lectures de séquençage des SAG ont été cartographiées sur des génomes de référence à l'aide de Bowtie264, les lectures ont été choisies au hasard pour être une couverture de 60 fois (E. coli) et 40 fois (bactéries intestinales humaines) de leurs génomes, et les profondeurs de séquençage par base ont été calculées à partir de les lectures à l'aide de SAMtools (http://www.htslib.org). Les coefficients de Gini des SAG ont été calculés à partir des profondeurs de séquençage moyennes par bac de 50 kb à l'aide du package Rineq. Les SAG, qui avaient des coefficients de Gini équivalents à leurs médianes, ont ensuite été tracés sur des courbes de Lorenz à l'aide du package R gglorenz.

Le taux de lecture chimérique a été calculé en cartographiant les lectures courtes sur le génome de référence avec le Barrows-Wheeler Aligner (https://sourceforge.net/projects/biobwa/files/) et SAMtools. Les génomes de référence sont répertoriés dans le tableau supplémentaire S4. Les contaminations croisées des données de séquençage génomique avec une contamination inférieure à 5 % à l'aide de CheckM29 (tableau supplémentaire S7) ont été calculées en cartographiant les lectures de séquençage aux génomes de référence dans la communauté fictive16.

Les fichiers fastq bruts (DRR253532 – DRR253885) et les assemblages pour les SAG de bactéries intestinales de termites (BNTM01000000 – BOCE01000000) ont été déposés dans DDBJ sous le numéro d'accès BioProject PRJDB10679.

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Ce travail a été soutenu par le RIKEN Pioneering Project "Biology of Symbiosis", JSPS KAKENHI Grants 16K07224 to H. A, and 17H01447 and 19H05679 to MO, and the Institute of Fermentation, Osaka to MY

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Hiroyoshi Aoki, Yuki Masahiro, Yuichi Hongoh, Moriya Ohkuma et Yutaka Yamagata.

Équipe de technologie optique ultra-haute précision, Groupe de technologie photonique avancée, RIKEN Center for Advanced Photonics, 3-1, Hirosawa, Wako, Saitama, 351-0198, Japon

Hiroyoshi Aoki et Yutaka Yamagata

Japan Collection of Microorganisms (JCM), RIKEN BioResource Research Center, 3-1-1, Koyadai, Tsukuba, Ibaraki, 305-0074, Japon

Yuki Masahiro, Michiru Shimizu, Yuichi Hongoh et Moriya Ohkuma

École des sciences et technologies de la vie, Institut de technologie de Tokyo, Tokyo, Japon

Yuichi Hongo

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YY et MO ont supervisé l'étude. HA, MY, YH et MO ont conçu l'étude. HA, MY et YH ont rédigé le manuscrit. HA a élaboré le protocole de préparation de l'AGA. MY et MS ont effectué le séquençage du génome suivant et les analyses de données ultérieures. Tous les auteurs ont contribué et édité le manuscrit.

Correspondance à Hiroyoshi Aoki ou Moriya Ohkuma.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Aoki, H., Masahiro, Y., Shimizu, M. et al. Les microcapsules de gel d'agarose permettent une génomique unicellulaire facile à préparer, à l'échelle du picolitre, produisant des séquences génomiques à couverture élevée. Sci Rep 12, 17014 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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Reçu : 19 janvier 2022

Accepté : 21 septembre 2022

Publié: 18 octobre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-20923-z

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