L'empagliflozine a supprimé la fibrogenèse cardiaque grâce au sodium

Diabétologie cardiovasculaire volume 22, Numéro d'article : 27 (2023) Citer cet article

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Le nouvel inhibiteur du co-transporteur sodium-glucose 2 (SGLT2i) améliore potentiellement l'insuffisance cardiaque et réduit l'arythmie cardiaque. La fibrose cardiaque joue un rôle central dans la physiopathologie de l'IC et de la myopathie auriculaire, mais l'effet du SGLT2i sur la fibrogenèse reste à élucider. Cette étude a examiné si SGLT2i module directement les activités des fibroblastes et ses mécanismes sous-jacents.

Migration, analyses de prolifération, dosage du pH intracellulaire, dosage de l'inositol triphosphate (IP3) intracellulaire, imagerie de fluorescence Ca2+ et Western blot ont été appliqués aux fibroblastes auriculaires humains. L'empagliflozine (un SGLT2i, 1 ou 5 μmol/L) a réduit la capacité de migration et la production de collagène de type I et III. Comparativement aux cellules témoins, les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) présentaient une fuite de Ca2+ du réticulum endoplasmique (ER) plus faible, une entrée de Ca2+, de l'inositol trisphosphate (IP3), une expression plus faible de la phospholipase C phosphorylée (PLC) et un pH intracellulaire plus faible. En présence de cariporide (un inhibiteur de l'échangeur Na+-H+ (NHE), 10 μmol/L), les fibroblastes auriculaires témoins et traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) ont révélé un pH intracellulaire similaire, une fuite de Ca2+ du RE, une entrée de Ca2+, une PLC phosphorylée, pro-collagène de type I, expression de protéines de type III et capacité de migration. De plus, l'empagliflozine (10 mg/kg/jour par voie orale pendant 28 jours consécutifs) a significativement augmenté la fonction systolique du ventricule gauche, le ß-hydroxybutyrate et diminué la fibrose auriculaire chez les rats HF induits par l'isoprotérénol (100 mg/kg, injection sous-cutanée).

En inhibant le NHE, l'empagliflozine diminue l'expression de la PLC phosphorylée et la production d'IP3, réduisant ainsi la libération de Ca2+ du RE, l'entrée de Ca2+ extracellulaire et les activités profibrotiques des fibroblastes auriculaires.

Les inhibiteurs du co-transporteur sodium-glucose 2 (SGLT2i) sont une nouvelle classe d'agents antidiabétiques qui réduisent le risque de décès cardiovasculaire et d'hospitalisation chez les patients souffrant d'insuffisance cardiaque (IC) et de diabète de type 2 [1, 2]. Le SGLT2i peut réduire la fibrose cardiaque et améliorer la fonction cardiaque [3, 4]. La fibrose auriculaire est une caractéristique distincte et critique de la myopathie auriculaire et de l'arythmogenèse auriculaire [5, 6]. Les patients atteints d'IC présentent une incidence plus élevée de fibrose auriculaire et le SGLT2i réduit la pression de remplissage auriculaire gauche et augmente la tolérance à l'effort et la fonction diastolique, qui sont toutes corrélées à la fibrose auriculaire [7,8,9,10,11,12]. Cependant, si et comment SGLT2i peut moduler la fibrogenèse auriculaire reste incertain.

La voie de signalisation du calcium (Ca2+) joue un rôle essentiel dans la fibrogenèse et induit la prolifération, la production de collagène, la migration et les capacités de différenciation des myofibroblastes des fibroblastes [13,14,15,16]. SGLT2i peut interagir directement avec le site de liaison Na+ extracellulaire de l'échangeur Na+/H+ (NHE) diminuant ainsi l'activité NHE et abaissant le pH intracellulaire [17].

Il a été prouvé que l'augmentation du pH intracellulaire induisait du Ca2+ cytosolique via une fuite ou un afflux de Ca2+ du réticulum endoplasmique (ER) [18, 19]. L'activité du NHE est régulée positivement chez les patients atteints d'IC [20, 21] et l'inhibition du NHE par le cariporide diminue la fibrose cardiaque dans l'IC [22,23,24]. L'activité accrue de NHE1 augmente le pH intracellulaire et active la capacité de migration cellulaire [21, 25]. La dapagliflozine atténue l'expression du gène NHE1 [26]. En conséquence, SGLT2i peut supprimer directement la fibrogenèse en inhibant la signalisation NHE, conduisant à un potentiel anti-fibrosant. Le but de cette étude était d'examiner si l'empagliflozine, un SGLT2i, pouvait diminuer la fibrogenèse auriculaire et d'étudier ses mécanismes sous-jacents.

Des fibroblastes auriculaires humains ont été achetés auprès du laboratoire de recherche Lonza (Walkersville, MD, États-Unis). Les fibroblastes ont été ensemencés sur des boîtes de culture non revêtues en monocouches dans FGM™-3 Cardiac Fibroblast Growth Medium-3 BulletKit (Lonza, y compris HEPES : 14,999 mmol/L et bicarbonate de sodium : 14,010 mmol/L) à 37 °C avec 5 % de CO2. Les cellules des passages 4 à 6 ont été utilisées pour éviter d'éventuelles variations de la fonction cellulaire. Le SGLT2 s'est avéré être présent dans les cellules par western blot (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1 pour l'expression de la protéine SGLT2).

La migration des fibroblastes auriculaires a été étudiée à l'aide d'un test de cicatrisation. En bref, les cellules ont été étalées dans des plaques à 6 puits et traitées avec de l'empagliflozine (1 ou 5 μmol/L ; MedChemExpress, NJ, USA) ou un inhibiteur de NHE (cariporide ; 10 μmol/L, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA ) pendant 48 h dans un milieu de culture sans sérum pendant 72 h. Six heures avant la fin du traitement, les cellules ont été grattées à l'aide de la pointe d'un embout de pipette P200. Chaque zone de l'écart a été évaluée à l'aide du logiciel Image J 1.45 s (National Institute of Health, Bethesda, MD, États-Unis). La zone de migration nette après 6 h a été soustraite de celle au moment de la rayure initiale.

La prolifération des fibroblastes auriculaires a été mesurée à l'aide d'un kit commercial MTS (Promega, Madison, WI, USA) comme décrit précédemment [27]. En bref, des fibroblastes auriculaires ont été ensemencés sur une boîte de culture à 96 puits à une densité de 3000 cellules/puits. Après croissance à 50 % de confluence, les cellules ont été incubées avec de l'empagliflozine (1 μmol/L, 5 μmol/L) dans du milieu de culture pendant 24 h. La croissance cellulaire a été analysée en ajoutant le réactif MTS 4 h avant l'analyse spectrophotométrique.

Western blot a été réalisé comme décrit précédemment [28]. Les fibroblastes auriculaires traités avec ou sans empagliflozine (1 ou 5 μmol/L) ou cariporide (10 μmol/L) pendant 48 h ont été lysés dans un tampon de test de radioimmunoprécipitation contenant 150 mmol/L NaCl, Nonidet P P40, 50 mmol/L Tris pH 7,4, désoxycholate de sodium à 0,5 %, dodécylsulfate de sodium à 0,1 % (SDS) et cocktails d'inhibiteurs de protéase (Sigma-Aldrich). Les protéines ont été fractionnées par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide à 10% et transférées sur une membrane de difluorure de polyvinylidène équilibrée (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Royaume-Uni). La protéine fractionnée a été sondée avec des anticorps primaires contre l'actine musculaire lisse (SMA) (1:1000, monoclonal, numéro de clone : 1A4, Abcam), pro-collagène de type IA1 (1:500, monoclonal, numéro de clone : 3G3, Santa- Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis), pro-collagène de type III (1:1000, monoclonal, numéro de clone : FH7A, Abcam), NHE1 (1:1000, polyclonal, Alomone Labs, Jérusalem, Israël) et PLCγ1 phosphorylé (1:1000, polyclonal, signalisation cellulaire, Beverly, MA, USA), suivie d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort. Les anticorps liés ont été détectés à l'aide d'un système de détection de chimioluminescence amélioré (Millipore, Darmstadt, Allemagne) et analysés à l'aide du logiciel AlphaEaseFC (Alpha Innotech, San Leandro, CA, USA). La protéine glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) (Sigma-Aldrich) a été utilisée comme contrôle de charge pour confirmer une charge protéique égale et a ensuite été normalisée à la valeur des cellules témoins.

Le pH intracellulaire a été calculé à l'aide d'un kit d'analyse de pH intracellulaire Cell Meter Fluorometric (AAT Bioquest, Sunnyvale, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. En bref, des fibroblastes auriculaires ont été ensemencés sur une plaque noire de culture à 96 puits à une densité de 3000 cellules/puits. Après croissance à confluence, les cellules ont été incubées avec de l'empagliflozine (1 μmol/L) ou du cariporide (10 μmol/L) pendant 6 h. Les cellules ont été chargées avec un colorant fluorescent perméable aux cellules sensible au pH 20,70-biscarboxyethyl-5,6-carboxyfluorescein-acetoxymethyl ester (BCECF-AM) dans un tampon de Hanks avec 20 mM HEPES et 4,17 mM bicarbonate de sodium pendant 1 h à 37 °C et 5% CO2, dans l'obscurité. Après un lavage ultérieur avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), la fluorescence a été mesurée à des longueurs d'onde d'excitation/émission (Ex/Em) de 505/535 nm et 430/535 nm sur un fluorimètre SpectraMax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) . Le rapport de fluorescence à 505/535 nm et 430/535 nm a été converti en unité de pH avec le kit de tampon d'étalonnage de pH intracellulaire Spexyte (AAT Bioquest). Des fibroblastes auriculaires chargés de BCECF-AM ont été incubés avec une gamme de tampons d'étalonnage (pH 4,5 - 8,0) à 37 °C pendant 10 min avec de la nigéricine (10 mmol/L), un ionophore protonique qui peut moduler le pH intracellulaire avec un pH externe dans la présence de 100 − 150 mmol/L K+.

Le Ca2+ intracellulaire a été mesuré avec un indicateur de Ca2+ ratiométrique Fura-2 à l'aide d'un lecteur de plaque à fluorescence comme décrit précédemment [29]. Les fibroblastes auriculaires ont été ensemencés sur des plaques de culture 96 puits noires transparentes à fond plat à une densité de 5 × 103 cellules/puits, après incubation pendant une nuit, les cellules ont été traitées avec ou sans empagliflozine (1 μmol/L) ou cariporide (10 μmol/ L) pendant 48h. Les cellules ont ensuite été colorées avec 5 μmol/L d'ester acétoxyméthylique de Fura-2 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) dans une solution sans Ca2+ avec (en mmol/L) KH2PO4 1.2, NaCl 120, MgSO4 1.2, KCl 5.4, HEPES 6, glucose 10 (pH 7,40) pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2. Les mesures de Ca2+ intracellulaire ont été effectuées toutes les 2 s avec une commutation rapide des longueurs d'onde d'excitation 340 et 380 nm et une longueur d'onde d'émission constante de 510 nm à l'aide d'un CLARIOstar PLUS Microplate Reader (BMG Lab Technologies, USA) équipé de deux injecteurs et analysées avec un Logiciel CLARIOstar MARS (BMG Lab Technologies). La concentration intracellulaire de Ca2+ dans chaque puits a été exprimée sous forme de rapport de fluorescence de F340/F380 et les changements de l'amplitude de calcium de base au pic ainsi que l'aire sous la courbe (AUC) du tracé de Ca2+ ont été calculés. Le temps de décroissance de l'entrée de Ca2+ (T50) a été calculé à partir du pic jusqu'à 50 % de la décroissance.

Le Ca2+ intracellulaire de base a été enregistré pendant 2 min dans un tampon sans Ca2+, suivi d'un co-traitement avec l'inhibiteur ER Ca-ATPase (thapsigargin, 2,5 μmol/L, Sigma-Aldrich) pour l'épuisement des réserves de Ca2+ ER. Après que la poussée de Ca2+ intracellulaire de la fuite de Ca2+ induite par la thapsigargine soit revenue à un état stable, la concentration de Ca2+ extracellulaire a été augmentée à 2 mmol/L pour mesurer l'entrée de Ca2+. La variation du Ca2+ intracellulaire (∆ F340/F380) de l'état d'équilibre sans Ca2+ extracellulaire à l'état de plateau du cotraitement à la thapsigargine a été définie comme la quantité de déplétion en Ca2+ du RE et le changement par rapport à l'état d'équilibre du Ca2+ induit par le RE après le RE. la montée subite de Ca2+ intracellulaire à l'état de plateau sous 2 mmol/L de solution de Ca2+ a été utilisée pour représenter l'entrée de Ca2+.

Les lysats cellulaires de fibroblastes auriculaires traités avec ou sans empagliflozine (1 μmol/L) ou cariporide (10 μmol/L) ont été dosés pour la production d'IP3 à l'aide d'un kit ELISA IP3 humain (Amsbio, Abingdon, Royaume-Uni) conformément aux instructions du fabricant. Les concentrations de protéines du lysat cellulaire de chaque traitement ont été utilisées pour la normalisation.

L'induction HF a été réalisée comme décrit précédemment [30]. Des rats mâles Wistar (pesant de 300 à 350 g) ont reçu une injection sous-cutanée d'une seule dose élevée d'isoprotérénol (100 mg/kg). 2 semaines après l'injection, le raccourcissement fractionnaire du ventricule gauche (LVFS) de ces rats a été analysé par échocardiographie. Les rats avec LVFS < 45 % ont été inclus dans les groupes HF [31]. Des rats HF ont ensuite été traités au hasard avec de l'empagliflozine (10 mg/kg/jour pendant 28 jours, Jardiance, Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Ridgefield, CT, USA) ou des véhicules. Après la fin du traitement de 28 jours, les rats traités et les rats témoins mâles en bonne santé appariés selon l'âge ont été euthanasiés avec une surdose d'isoflurane à 5 % (dans l'oxygène) pour analyse histologique. Tous les protocoles d'animaux étaient conformes au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals publié par les National Institutes of Health des États-Unis (NIH Publication No. 85-23, révisé 2011) et ont été approuvés par le comité local d'examen de l'éthique animale (LAC-2021- 0223). Les études animales sont rapportées conformément aux recommandations ARRIVE [32] et aux recommandations du British Journal of Pharmacology [33].

Une échocardiographie a été réalisée avant l'euthanasie. Les rats ont été mis sous sédation avec 2 % d'isoflurane (dans de l'oxygène), placés en position de décubitus latéral gauche et scannés à l'aide d'un échographe disponible dans le commerce (système cardiovasculaire à ultrasons Vivid i, GE Healthcare, Haïfa, Israël) à l'aide d'un transducteur pédiatrique à réseau phasé 10S et une application cardiaque à haute résolution temporelle et spatiale. La fréquence d'émission était de 10 MHz ; la profondeur 2,5 cm; et la fréquence d'images 225 images/s. Le diamètre télédiastolique du VG (LVEDD), le diamètre télésystolique du VG (LVESD), l'épaisseur de la paroi postérieure du VG (LVPW) et la fréquence cardiaque (HR) ont été mesurés. Le raccourcissement fractionnaire (%) a été mesuré comme (LVEDD-LVEDD)/LVEDD × 100.

Le sérum sanguin a été prélevé avant l'euthanasie et dosé pour le ß-OH à l'aide d'un kit de dosage fluorométrique ß-OH (Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI, USA) conformément aux instructions du fabricant.

L'analyse de la fibrose auriculaire a été réalisée selon une méthode décrite précédemment avec modification [30]. En bref, les tissus auriculaires gauches (LA) ont été fixés dans du formaldéhyde à 4 %, inclus dans de la paraffine et colorés avec la coloration au trichrome de Masson. Des images en fond clair des tissus LA ont été obtenues. La fibrose LA a été évaluée à l'aide de la fraction volumique de collagène (le rapport de la surface totale de collagène à la surface totale de LA). Les tissus LA entiers sectionnés ont été évalués à l'aveugle pour le dépôt de collagène avec le logiciel d'analyse HistoQuest (version 4.0, TissueGnostics, Vienne, Autriche).

Toutes les données quantitatives sont exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne. Un test t apparié ou non apparié pour la distribution normale, un test de somme des rangs de Mann-Whitney pour une distribution non normale et une ANOVA à un facteur ou une ANOVA à mesures répétées ou une ANOVA sur les rangs avec un test de différence la moins significative (LSD) de Fisher post hoc ont été utilisés pour comparer les fibroblastes auriculaires dans différentes conditions. AP < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

Par rapport aux cellules témoins, les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 ou 5 μmol/L) présentaient une capacité de migration plus faible et une expression des protéines pro-collagène de type I et III plus faible de manière dose-dépendante (Fig. 1). Cependant, les fibroblastes auriculaires témoins et traités à l'empagliflozine avaient une expression d'α-SMA (un marqueur de différenciation des myofibroblastes) et un taux de prolifération similaires (Fig. 1).

Migration cellulaire, production de collagène, différenciation des myofibroblastes et capacités de prolifération des fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine. A Des photographies et des données moyennes ont révélé les résultats du test de migration des fibroblastes auriculaires traités avec l'empagliflozine (1 ou 5 μmol/L). Les panneaux supérieurs gauches affichaient la rayure initiale (ligne de base) dans différents groupes. Les panneaux inférieurs gauches affichaient les images 6 h après la création de la rayure (après migration) (n = 6 expériences indépendantes, test statistique par ANOVA à mesures répétées unidirectionnelles). B Les photographies et les données moyennes ont révélé l'expression du pro-collagène de type I, III et de l'actine α-musculaire lisse (SMA) (n = 6 expériences indépendantes, test statistique par ANOVA à mesures répétées unidirectionnelles) chez le contrôle et l'empagliflozine (1 ou 5 μmol/L) de fibroblastes auriculaires traités. GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. C Un traitement à l'empagliflozine pendant 24 h n'a eu aucun effet significatif sur le taux de prolifération des fibroblastes auriculaires (n = 6 expériences indépendantes, test statistique par ANOVA à mesures répétées à un facteur). * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Légende de la figure dans la section des résultats.

Les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) présentaient une fuite de Ca2+ ER induite par la thapsigargine, une entrée de Ca2+ extracellulaire et une décroissance plus courte du Ca2+ pendant la phase d'entrée du Ca2+ par rapport aux cellules témoins (Fig. 2) Empagliflozine (1 μmol/L) fibroblastes auriculaires présentaient une expression plus faible de PLC phosphorylée et d'IP3 (Fig. 2).

Signalisation Ca2+ intracellulaire dans les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine. Un Ca2+ intracellulaire représentatif provenant de témoins (panneaux supérieurs gauches) et de fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L, panneaux supérieurs droits). Lorsque cela était indiqué, de la thapsigargine a été ajoutée au tampon sans calcium pour induire une déplétion du RE en Ca2+. Après que la poussée de Ca2+ intracellulaire induite par la thapsigargine (ER calcium) soit revenue à l'état d'équilibre, la concentration de Ca2+ extracellulaire a ensuite été augmentée à 2 mmol/L pour mesurer l'entrée de Ca2+. F340/F380 a été exprimé en tant que Ca2+ intracellulaire relatif. Le panneau inférieur gauche affiche le changement (∆ F340/F380) de Ca2+ mesuré par l'aire sous la courbe du tracé de Ca2+ (AUC, test statistique par test t non apparié), le changement de l'amplitude du calcium de base au pic (test statistique de Mann–Whitney Rank Sum Test), et le temps de décroissance de l'entrée du Ca2+ (T50, calculé du pic aux 50 % de décroissance ou à la fin de l'enregistrement de l'image calcique, test statistique par test t non apparié) dans le contrôle (n = 5) et fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (n = 5). B Données moyennes des niveaux d'IP3 dans les cellules témoins et les fibroblastes traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) pendant 48 h (n = 6 expériences, test statistique par paire t-test). C Photographies et données moyennées de l'expression de la phospholipase C phosphorylée (pPLC) dans les cellules témoins et les fibroblastes traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) pendant 48 h (n = 6 expériences indépendantes, test statistique par test t apparié). GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Par rapport aux cellules témoins, les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) présentaient un pH intracellulaire plus faible mais avaient une expression similaire de la protéine NHE1 (Fig. 3). En présence de cariporide (un inhibiteur de NHE, 10 μmol/L), les fibroblastes auriculaires témoins et traités à l'empagliflozine présentaient des niveaux similaires de pH intracellulaire, d'expression de PLC phosphorylée, de NHE1, de production de collagène de type I, de type III, de capacité de migration ( Figs. 3 et 4), fuite de Ca2+ ER, entrée de Ca2+ extracellulaire et T50 pendant la phase d'entrée de Ca2+ (Fig. 5), suggérant que l'empagliflozine a diminué les activités profibrotiques des fibroblastes auriculaires en atténuant la signalisation PLC/récepteur IP3/ER Ca2+ par inhibition de la voie de signalisation NHE.

Effets de l'empagliflozine sur l'échangeur Na+/H+ (NHE) et la signalisation en aval. A Données moyennes du pH intracellulaire dans les cellules témoins et les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) cotraités avec ou sans cariporide (10 μmol/L) pendant 48 h (n = 6 expériences, test statistique par répétition unidirectionnelle mesure ANOVA). B Photographies et données moyennes de l'expression du pro-collagène de type I, de type III, de la phospholipase C phosphorylée (pPLC) et de la protéine NHE1 dans les cellules témoins et les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) cotraités avec ou sans cariporide (10 μmol/L) pendant 48 h (n = 6 expériences, test statistique par ANOVA à mesures répétées à un facteur). GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. * p < 0,05, $ p < 0,005

Les effets de l'inhibiteur de l'échangeur Na+/H+ (cariporide) sur l'empagliflozine ont diminué la migration dans les fibroblastes auriculaires. Des photographies et des données moyennes présentent les résultats du test de migration des fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (1 μmol/L) traités avec ou sans cariporide (10 μmol/L). Les panneaux supérieurs affichent la rayure initiale (ligne de base) dans différents groupes. Les panneaux inférieurs affichent les images 6 h après la création de la rayure (après migration) (n = 6 expériences indépendantes, test statistique par ANOVA à mesures répétées unidirectionnelles). * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Signalisation intracellulaire du Ca2+ dans les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine ou au cariporide. Représentation intracellulaire Ca2 + traçage du cariporide seul (10 μmol/L, panneaux supérieurs gauches) et du cariporide (10 μmol/L) mélangé à de l'empagliflozine (1 μmol/L, panneaux supérieurs droits). Lorsque cela était indiqué, de la thapsigargine a été ajoutée au tampon sans calcium pour induire une déplétion du RE en Ca2+. Après que la poussée de Ca2+ intracellulaire induite par la thapsigargine (ER calcium) soit revenue à l'état d'équilibre, la concentration de Ca2+ extracellulaire a ensuite été augmentée à 2 mmol/L pour mesurer l'entrée de Ca2+. F340/F380 a été exprimé en tant que Ca2+ intracellulaire relatif. Le panneau inférieur gauche affiche le changement (∆ F340/F380) du Ca2+ mesuré par l'aire sous la courbe du tracé du Ca2+ (AUC, test statistique par test t non apparié), le changement de l'amplitude du calcium de référence au pic (test statistique par test statistique par test t non apparié), et le temps de décroissance de l'entrée du Ca2+ (T50, calculé du pic aux 50 % de la décroissance ou à la fin de l'enregistrement de l'image calcique, test statistique par test t non apparié) dans le cariporide seul (n = 5) et cariporide mélangé à des fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine (n = 5)

Comme le montre la figure 6A, nous avons étudié les effets de l'empagliflozine sur la structure cardiaque, la fonction systolique, la ß-OH sérique et la fibrose auriculaire in vivo. Les résultats de l'échocardiographie ont révélé que les rats traités à l'isoprotérénol recevant des véhicules présentaient une fonction systolique basse du VG (LVFS) et une LVESD avec une LVPW, une LVEDD et une HR similaires à celles des rats témoins. Les rats traités à l'isoprotérénol recevant de l'empagliflozine avaient une fonction systolique LV (LVFS) plus élevée avec des LVESD, LVEDD et HR similaires par rapport aux rats traités à l'isoprotérénol recevant des véhicules (Fig. 7).

Effets de l'empagliflozine sur des rats atteints d'insuffisance cardiaque induite par l'isoprotérénol (IC). Un schéma résumant le protocole de traitement pour les rats Wistar avec des véhicules recevant une HF induite par l'isoprotérénol (100 mg/kg, injection sous-cutanée), des rats HF recevant de l'empagliflozine (10 mg/kg/jour par voie orale pendant 28 jours consécutifs) et des rats témoins. Les données moyennes B présentent les résultats des taux sériques de ß-hydroxybutyrate (test statistique par ANOVA à un facteur) chez des rats HF recevant des véhicules (n = 5), des rats HF recevant de l'empagliflozine (n = 5) et des rats témoins (n = 5 ). C Les photographies révèlent la fibrose auriculaire (colorée en bleu) étudiée à l'aide de la coloration au trichrome de Masson (test statistique par ANOVA à un facteur) dans les tissus de l'oreillette gauche (LA) de différents groupes. Les rats témoins (n = 5) et les rats HF recevant de l'empagliflozine (n = 5) ont présenté une fibrose LA moins sévère que les rats HF traités avec le véhicule (n = 5). Les niveaux de fibrose des tissus LA ont été exprimés en fraction volumique de collagène, c'est-à-dire le rapport de la surface totale de collagène LA colorée en bleu à la surface totale LA. * p < 0,05, # p < 0,01, $ p < 0,005

Effets de l'empagliflozine sur la structure cardiaque, la fonction systolique et la fréquence cardiaque de rats atteints d'insuffisance cardiaque induite par l'isoprotérénol (IC). Des photographies et des données moyennes présentent les résultats du raccourcissement fractionnaire du ventricule gauche (LVFS, test statistique par ANOVA unidirectionnelle), de la paroi postérieure du VG (LVPW, test statistique par ANOVA unidirectionnelle), du diamètre télédiastolique du VG (LVEDD, test statistique par ANOVA sur les rangs), diamètre télésystolique VG (LVESD, test statistique par ANOVA à un facteur) et fréquence cardiaque (HR, test statistique par ANOVA à un facteur) chez les rats HF recevant des véhicules (n = 5), les rats HF recevant empagliflozine (n = 5) et des rats témoins (n = 5). * p < 0,05, $ p < 0,005

Les taux sériques de ß-OH ont révélé que les rats traités à l'isoprotérénol recevant de l'empagliflozine présentaient un taux sérique de β-hydroxybutyrate plus élevé que le HF traité avec des véhicules et des rats témoins sains avant l'euthanasie (Fig. 6B). La coloration au trichrome de Masson a montré que les rats traités à l'isoprotérénol présentaient une fibrose LA plus élevée que les rats témoins et que l'empagliflozine diminuait significativement la fibrose LA chez les rats traités à l'isoprotérénol (Fig. 6C).

Il a été démontré que l'empagliflozine améliore la fibrose cardiaque dans divers modèles expérimentaux d'IC [4], mais les mécanismes sous-jacents de l'effet anti-fibrogène n'ont pas été entièrement élucidés. À notre connaissance, il s'agit de la première étude rapportant que l'empagliflozine (1 μmol/L) a interrompu l'homéostasie du Ca2+ en inhibant l'activité NHE dans les fibroblastes auriculaires humains, réduisant ainsi leurs activités cellulaires pro-fibrotiques. Les cardiomyocytes avec surexpression de NHE avaient un pH intracellulaire plus élevé. Les souris présentant une surexpression de NHE présentaient une HF et une fibrose cardiaque, qui peuvent être améliorées par le cariporide, un inhibiteur de NHE1 [34]. Dans cette étude, nous avons observé que l'empagliflozine abaissait le pH intracellulaire des fibroblastes auriculaires sans modifier l'expression de la protéine NHE1, une isoforme prédominante dans le cœur [35]. De plus, le cariporide avec et sans empagliflozine a réduit les activités cellulaires pro-fibrotiques des fibroblastes auriculaires dans une mesure similaire, suggérant que l'empagliflozine pourrait diminuer les activités des fibroblastes auriculaires en atténuant l'activation de la signalisation NHE.

Un pH intracellulaire élevé active la voie de signalisation du récepteur PLC/IP3, induisant ainsi la libération ou l'influx de Ca2+ du RE [36]. Les cytokines pro-fibrotiques induisent la sécrétion de collagène par la voie de signalisation du récepteur PLC/IP3, tandis que l'inhibition de la voie de signalisation PLC diminue la capacité de production de collagène [37]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'empagliflozine diminuait significativement le pH intracellulaire, la PLC phosphorylée et l'IP3 intracellulaire. De plus, le cariporide avec et sans empagliflozine a réduit le pH intracellulaire et la PLC phosphorylée des fibroblastes auriculaires dans une mesure similaire. Ces résultats suggèrent que l'empagliflozine pourrait atténuer la fibrogenèse auriculaire en inhibant la voie de signalisation du récepteur PLC/IP3 par inhibition de la signalisation NHE. De même, dans les myocytes auriculaires, une exposition aiguë à l'empagliflozine a abaissé le pH intracellulaire et atténué l'activité NHE. Cette atténuation a également été obtenue par incubation avec le cariporide [38]. L'empagliflozine a significativement atténué le flux de NHE, réduisant ainsi le Na+ et le Ca2+ cytosoliques dans les myocytes ventriculaires [39]. En présence de cariporide, l'effet d'atténuation de l'empagliflozine était fortement supprimé dans le fibroblaste auriculaire, ce qui suggère que l'effet d'inhibition du NHE était équivalent au cariporide.

Notre étude précédente a montré que l'empagliflozine atténuait la réduction de la teneur en Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (SR) dans les myocytes diabétiques [3]. En outre, l'empagliflozine peut également diminuer la fuite de Ca2+ SR [40], ce qui suggère que l'empagliflozine peut diminuer la fuite de Ca2+ ER. L'inhibition de la fuite de ER Ca2+ interrompt la signalisation en aval de la cytokine pro-fibrotique [37] La présente étude a révélé que l'empagliflozine réduisait la libération de ER Ca2+ induite par la thapsigargine, ce qui suggère qu'elle réduisait la voie de signalisation de la libération de PLC/IP3/ER Ca2+ en diminuant le pH intracellulaire par l'inhibition du NHE, entraînant une diminution de la production de collagène. L'activation Ca2+-dépendante de la PLC a été prouvée dans diverses cellules [41, 42]. Le myocarde ischémique perfusé avec une solution riche en Ca2+ augmente l'activité de la PLC tandis que la perfusion avec un inhibiteur des canaux de Ca2+ diminue l'activité de la PLC [43]. Le SGLT2i a réduit le Na+ intracellulaire en s'arrimant directement au canal sodique tardif (Nav1.5), en inhibant l'influx de NHE et en mode inverse de NCX, diminuant ainsi la teneur en Ca2+ intracellulaire dans les cardiomyocytes [39, 44, 45]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'empagliflozine diminue significativement le Ca2+ cytosolique. Par conséquent, l'effet de l'empagliflozine sur la diminution de l'activité de la PLC peut également être causé par la diminution du Ca2+ cytosolique dans les fibroblastes auriculaires traités à l'empagliflozine. Les passerelles d'entrée du Ca2+ comprennent les canaux Orai, les canaux de potentiel de récepteur transitoire (TRP), les canaux de Ca2+ commandés en tension ou NCX. La signalisation atténuée du canal Orai réduit les capacités de production de collagène des fibroblastes auriculaires [46]. Le facteur de croissance transformant active les activités pro-fibrotiques des fibroblastes auriculaires via les canaux TRP [47]. La vidange du RE Ca2+ peut activer les canaux Orai [48, 49]. Les canaux TRP peuvent être activés par la signalisation PLC [50, 51]. Une étude précédente a révélé que le SGLT2i diminue la vasoconstriction induite par le sel grâce à l'inhibition des canaux TRP [45]. Le SGLT2i peut également diminuer la surcharge en Ca2+ via le canal Ca2+ de type L (une sorte de canal Ca2+ commandé en tension) dans les cardiomyocytes [52]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'empagliflozine diminuait la vidange du RE Ca2+, l'activité PLC et l'entrée extracellulaire du Ca2+. En outre, le cariporide avec et sans empagliflozine a réduit la fuite de Ca2+ du RE et l'entrée de Ca2+ extracellulaire des fibroblastes auriculaires dans une mesure similaire, ce qui suggère que l'empagliflozine peut diminuer, suggérant que l'empagliflozine a diminué le Ca2+ cytosolique par inhibition de la voie de signalisation NHE.

L'extrusion cytoplasmique du Ca2+ peut être réalisée par un efflux de Ca2+ à travers les ATPases de la membrane plasmique (PMCA) et les échangeurs Na+/Ca2+ en mode direct sur la membrane cellulaire, ou en pompant le Ca2+ vers le RE via la SR Ca2+-ATPase (SERCA) sur la membrane du RE. Il a été prouvé que l'augmentation du pH intracellulaire inhibe la capacité de recapture du RE Ca2+ de SERCA [53]. Dans la présente étude, nous avons constaté que l'empagliflozine raccourcissait le temps de décroissance de la phase d'entrée du Ca2+. En outre, le cariporide avec et sans empagliflozine a raccourci le temps de décroissance de la phase d'entrée du Ca2+ des fibroblastes auriculaires dans une mesure similaire. Par conséquent, l'empagliflozine pourrait améliorer la fonction SERCA et augmenter la recapture du ER Ca2+, raccourcissant ainsi le temps de décroissance de la phase d'entrée du Ca2+ des fibroblastes auriculaires via son effet sur la diminution du pH intracellulaire.

L'inhibition du NHE par l'empagliflozine peut réduire le Ca2+ intracellulaire et diminuer la contraction cardiaque. Cependant, des études antérieures ont montré que l'empagliflozine atténuait l'HF et augmentait la teneur en Ca2+ dans les cardiomyocytes diabétiques, qui étaient supposées provenir de ses effets stimulants sur l'expression de SERCA et les courants calciques de type L [3]. La réduction de l'activité NHE par l'empagliflozine peut réduire le stress oxydatif, entraînant un effet cardioprotecteur [3]. De plus, la réduction de la fibrogenèse améliore l'IC [54, 55]. Par conséquent, l'empagliflozine peut améliorer l'IC via son potentiel anti-fibrosant et ses effets inotropes (fonction SERCA améliorée et teneur en Ca2+ dans les cardiomyocytes). L'isoprotérénol active la signalisation de la protéine kinase II Ca2+/calmoduline-dépendante (CaMKII) et induit une fréquence d'étincelle Ca2+ aberrante, induisant ainsi une arythmogenèse en cas d'insuffisance cardiaque [56, 57]. L'empagliflozine module divers canaux ioniques, notamment les canaux Ca2+ [52], les canaux Na+ [44] et les canaux K+ [58], ce qui suggère que l'empagliflozine pourrait moduler l'activité électrique cardiaque. Il a été démontré que l'empagliflozine réduit l'arythmie ventriculaire induite par l'isoprotérénol dans le cœur diabétique [59]. Il a été prouvé que l'empagliflozine diminue la fréquence des étincelles de Ca2+ et atténue les activités de CaMKII dans les cardiomyocytes défaillants [40]. Par conséquent, dans nos modèles HF, l'empagliflozine pourrait atténuer le dysfonctionnement cardiaque induit par l'isoprotérénol en atténuant le dysfonctionnement de SERCA ou la fuite de calcium due au récepteur phosphorylé de la ryanodine dans l'IC en réduisant le stress oxydatif ou l'activité CaMKII [3, 40, 60]. L'isoprotérénol augmente la fréquence cardiaque par stimulation bêta-adrénergique dans la pratique clinique. De plus, un traitement à long terme par l'isoprotérénol peut réguler négativement les récepteurs bêta-1 adrénergiques, entraînant une diminution ou une perte d'efficacité des agonistes des récepteurs bêta-adrénergiques [61]. L'isoprotérénol a été largement utilisé pour l'induction de modèles animaux HF. Cependant, l'augmentation significative de la FC après induction de l'HF avec l'isoprotérénol n'est pas cohérente entre les différentes études [62, 63]. Dans la présente étude, nous avons constaté qu'il n'y a pas de différence significative entre les rats témoins sains et les rats HF, ce qui est peut-être attribué à la fréquence d'injection d'isoprotérénol (une seule fois) et au moment de la mesure de la fréquence cardiaque (6 semaines après l'injection d'isoprotérénol).

Les patients DM traités avec SGLT2i présentaient des niveaux plus élevés de cétone (β-OHB) [64, 65]. Le SGLT2i active la lipolyse et diminue les niveaux d'insuline, entraînant ainsi la production de cétones dans le foie [66]. Le β-OHB peut également améliorer le débit cardiaque et la fonction systolique des patients atteints d'IC [67]. Dans la présente étude, nous avons constaté que la fonction systolique du VG et le taux sérique de β-OHB sont plus élevés chez les rats HF traités avec l'empagliflozine que chez les rats HF traités avec des véhicules, ce qui suggère que le β-OHB pourrait contribuer aux effets cardioprotecteurs de l'empagliflozine.

Une fibrose auriculaire plus sévère est associée à une incidence plus élevée de fibrillation auriculaire [68]. L'empagliflozine a diminué la fibrose ventriculaire chez les rats diabétiques [69]. Dans la présente étude, l'empagliflozine a réduit la fibrose auriculaire chez les rats traités à l'isoprotérénol, nous avons constaté que l'empagliflozine réduisait la fibrose auriculaire. Pour corréler avec les paramètres cliniques, nous avons traité les fibroblastes auriculaires avec 1 μmol/L d'empagliflozine (une concentration similaire à la concentration plasmatique maximale d'empagliflozine chez les patients atteints de diabète de type 2 après la prise de doses orales multiples [70, 71]). Cette découverte a indiqué la pertinence clinique de l'effet anti-fibrogène de l'empagliflozine dans les fibroblastes auriculaires humains. En conséquence, SGLT-2i peut être une stratégie thérapeutique potentielle.

Il y avait quelques limitations dans cette étude. Premièrement, SGLT2i a amélioré les relations pression-volume télésystolique et télédiastolique dans des modèles animaux diabétiques selon des expériences de boucle pression-volume [72]. Cependant, cette étude n'a pas mené cette expérience. Par conséquent, les effets du SGLT2i sur le comportement d'activation ou de relaxation du myocarde HF ne sont pas clairs. De plus, par rapport aux cellules témoins, les fibroblastes auriculaires présentaient un pH intracellulaire inférieur sous 6 h de traitement à l'empagliflozine via la signalisation NHE. Néanmoins, on ne sait toujours pas combien de temps l'empagliflozine agit pour modifier le pH intracellulaire dans les fibroblastes auriculaires. De plus, cette étude a mesuré la taille de la chambre et la fonction cardiaque 6 semaines après le traitement à l'isoprotérénol. L'épaisseur similaire entre les rats témoins et HF pourrait être attribuée aux résultats nets de la perte de myocarde et de l'hypertrophie compensatoire des myocytes ventriculaires. Une étude précédente a révélé que de jeunes rats adultes wistar HF induits par une dose élevée (170 mg/kg/j) d'isoprotérénol avaient une épaisseur similaire de la paroi postérieure du VG 4 semaines et 8 semaines après l'induction de l'HF [73]. De même, l'IC induite par 85 ou 170 mg/kg/j d'isoprotérénol chez les rats wistar n'a augmenté la masse du VG qu'à 16 semaines, mais pas 2 ou 6 semaines après l'induction de l'IC [74]. Ces résultats suggèrent que l'hypertrophie ventriculaire dans l'IC induite par l'isoprotérénol peut dépendre de la dose et de la durée. Ainsi, une durée plus longue après le traitement à l'isoprotérénol peut avoir un impact différent sur l'épaisseur de la paroi postérieure du VG. Enfin, pour imiter le scénario clinique, nous n'avons pas mesuré l'effet de l'empagliflozine sur les cœurs de rats témoins, et les effets de l'empagliflozine sur les animaux sains ne sont pas élucidés dans cette étude. Cependant, des études ont révélé que l'empagliflozine pourrait ne pas affecter la fibrose cardiaque, l'épaisseur de la paroi ventriculaire et la fraction d'éjection des rats sains [75, 76].

En conclusion, comme résumé dans la Fig. 8, en inhibant le NHE, l'empagliflozine diminue l'expression de la production de PLC phosphorylée et d'IP3, réduisant ainsi la libération de Ca2+ ER, l'entrée de Ca2+ extracellulaire et les activités profibrotiques des fibroblastes auriculaires.

Le mécanisme moléculaire proposé sous-tendant les effets anti-fibrotiques de l'empagliflozine sur les fibroblastes auriculaires. En inhibant l'échangeur Na+-H+ (NHE), l'empagliflozine diminue l'expression de la phospholipase C phosphorylée (PLC) et la production d'inositol trisphosphate (IP3) réduisant ainsi la libération de Ca2+ du RE, l'entrée de Ca2+ extracellulaire et diminuant les activités cellulaires profibrotiques des fibroblastes auriculaires

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Les auteurs reconnaissent les services techniques fournis par l'installation centrale de l'Université médicale de Taipei (TMU) pour les expériences d'image Ca2+. Les auteurs remercient le Laboratory Animal Center de TMU pour son soutien technique à cette étude animale.

Ce travail a été soutenu par l'Université médicale de Taipei - Hôpital Wan Fang [108-wf-swf-06] et le Ministère des sciences et de la technologie de Taïwan (MOST 108-2314-B-038-117-MY3, MOST 111-2314-B -038-027-MY3).

Division de cardiologie, Département de médecine interne, École de médecine, Faculté de médecine, Université médicale de Taipei, Taipei, Taïwan

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin et Yi-Jen Chen

Division de médecine cardiovasculaire, Département de médecine interne, Hôpital Wan Fang, Université médicale de Taipei, Taipei, Taïwan

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin et Yi-Jen Chen

Institut de cardiologie de Taipei, Université médicale de Taipei, Taipei, Taïwan

Cheng-Chih Chung, Yung-Kuo Lin et Yi-Jen Chen

Département de génie biomédical, Centre médical de la Défense nationale, Taipei, Taïwan

Yao-Chang Chen

Graduate Institute of Clinical Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, No. 250, Wu-Hsing Street, 11031, Taipei, Taiwan

Yu-Hsun Kao et Yi-Jen Chen

Département d'éducation et de recherche médicales, Hôpital Wan Fang, Université médicale de Taipei, Taipei, Taïwan

Yu-Hsun Kao

Division de cardiologie, Chang Gung Memorial Hospital, Taoyuan, Taïwan

Yung-Hsin Yeh

Faculté de médecine, Université Chang Gung, Taoyuan, Taïwan

Yung-Hsin Yeh

Centre de radiologie, Hôpital Bach Mai, Hanoï, Vietnam

Nguyen Ngoc Trang

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L'étude a été conceptualisée par C-CC, Y-HK et Y-JC. Y-KL, Y-CC et N-NT ont réalisé des expériences cellulaires et animales. C-CC a recueilli les données avec Y-HK et Y-HY et a rédigé le manuscrit. Y-JC a supervisé l'ensemble de l'étude et a révisé et édité le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Yu-Hsun Kao ou Yi-Jen Chen.

Tous les matériaux cellulaires humains ont été approuvés par le comité d'examen conjoint de l'université médicale de Taipei (TMU-JIRB. No.:N202202048). Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le comité local d'examen de l'éthique animale (LAC-2021-0223).

Au nom de tous les auteurs, l'auteur correspondant déclare qu'il n'y a pas de concurrence d'intérêts.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Fichier complémentaire 1 : Fig. S1. La protéine SGLT2 est exprimée dans les fibroblastes auriculaires humains.

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Réimpressions et autorisations

Chung, CC., Lin, YK., Chen, YC. et coll. L'empagliflozine a supprimé la fibrogenèse cardiaque par l'inhibition de l'échangeur sodium-hydrogène et la modulation de l'homéostasie calcique. Diabétol cardiovasculaire 22, 27 (2023). https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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Reçu : 12 août 2022

Accepté : 26 janvier 2023

Publié: 06 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12933-023-01756-0

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L'empagliflozine a supprimé la fibrogenèse cardiaque grâce au sodium