Analyse du transcriptome de l'AAV

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 19395 (2022) Citer cet article

1700 accès

5 Altmétrique

Détails des métriques

Les rétinopathies sont des maladies multifactorielles avec des pathologies complexes qui conduisent à terme à une perte de vision. Les modèles animaux facilitent la compréhension de la physiopathologie et l'identification de nouvelles options de traitement. Cependant, chaque modèle animal ne reflète que des aspects spécifiques de la maladie et la compréhension des changements moléculaires spécifiques dans la plupart des modèles de maladie est limitée. Ici, nous avons effectué une analyse du transcriptome du tissu oculaire murin transduit avec des virus adéno-associés recombinants (AAV) exprimant soit le VEGF-A humain, le TNF-α ou l'IL-6. L'expression du VEGF a conduit à une régulation distincte des gènes associés à la matrice extracellulaire (ECM). En revanche, le TNF-α et l'IL-6 ont entraîné des changements d'expression génique plus comparables dans la signalisation de l'interleukine et la cascade du complément, les changements induits par le TNF-α étant plus prononcés. De plus, l'intégration des données de séquençage d'ARN unicellulaire a suggéré une augmentation des gènes marqueurs spécifiques aux cellules endothéliales par le VEGF, tandis que l'expression du TNF-α augmentait l'expression des marqueurs des lymphocytes T. L'expression de TNF-α et d'IL-6 a entraîné une augmentation des marqueurs macrophages. Enfin, les modifications transcriptomiques chez les souris traitées à l'AAV-VEGF se chevauchent largement avec les modifications de l'expression génique observées dans le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène, en particulier en ce qui concerne les composants de la MEC et l'expression des gènes spécifiques aux cellules endothéliales. Dans l'ensemble, notre étude représente une enquête précieuse sur les changements d'expression génique induits par le VEGF, le TNF-α et l'IL-6 et aidera les chercheurs à sélectionner des modèles animaux appropriés pour les rétinopathies en fonction de leur accord avec la physiopathologie humaine.

Les rétinopathies telles que la rétinopathie diabétique (RD), la dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA), l'uvéite ou la rétinopathie du prématuré (ROP) présentent des pathologies complexes chez les patients, notamment des vasculopathies, une inflammation, une neurodégénérescence et une fibrose, conduisant finalement à la cécité. Un certain nombre de modifications moléculaires ont été associées à ces pathologies rétiniennes, par exemple des modifications de l'expression du facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) ou de l'interleukine-6 ​​(IL-6). Le VEGF provoque une fuite vasculaire et une néovascularisation pathologique, et il a été démontré que la protéine VEGF est régulée positivement dans la DMLA humide1, la DR2, l'œdème maculaire diabétique (DME)3 et la ROP4. En conséquence, le traitement anti-VEGF est devenu la norme de soins pour la DMLA5 humide et le DME6. Une autre caractéristique commune de nombreuses rétinopathies est l'inflammation : les cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α ainsi que les protéines IL-6 sont régulées à la hausse dans le vitré des patients atteints de RD7,8 et d'uvéite9,10.

Divers modèles précliniques de rongeurs ont directement ou indirectement mis en lumière la fonction du VEGF, du TNF-α ou de l'IL-6 dans les rétinopathies. Un modèle animal fréquemment utilisé présentant des pathologies vasculaires, similaires à celles observées dans les rétinopathies prolifératives telles que la DMLA humide ou la ROP, est le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène (OIR)11,12. Des souris transgéniques exprimant le VEGF13,14,15, une injection intraoculaire de la protéine VEGF recombinante16,17,18 ou des virus adéno-associés (AAV) recombinants exprimant le VEGF19,20,21,22,23 ont en outre démontré que le VEGF est non seulement nécessaire mais également suffisant pour provoquer des vasculopathies. En conséquence, le traitement anti-VEGF empêche la néovascularisation dans le modèle OIR17,24 et ces études précliniques ont ouvert la voie aux thérapies anti-VEGF modernes. De plus, les processus inflammatoires observés chez les patients atteints de rétinopathies peuvent également être modélisés chez les rongeurs, par exemple par des modèles murins d'uvéite tels que les uvéites induites par des endotoxines ou des antigènes25,26,27 ou des souris transgéniques dépourvues du gène Aire28,29. De même, les protéines recombinantes ou l'expression médiée par l'AAV du TNF-α et de l'IL-6 induit une inflammation dans l'œil des rongeurs, bien que la fonction directe de l'IL-6 soit plus controversée19,30,31,32. Là encore, un traitement anti-TNF-α ou anti-IL-6 améliore les pathologies induites dans divers modèles d'uvéites33,34,35.

Dans le contexte de la recherche préclinique, le transfert de gènes médié par l'AAV est récemment apparu comme une méthode puissante pour créer de nouveaux modèles animaux. Comme principal avantage, les AAV permettent l'expression à long terme d'un transgène d'une manière spécifique au type de tissu et de cellule. Auparavant, nous avons montré que l'expression médiée par l'AAV conduit à une expression constante et à long terme de transgènes humains à 1, 3 et 6 semaines après l'injection IVT19. Nous avons en outre démontré que l'expression médiée par l'AAV du VEGF, du TNF-α et de l'IL-6 humains dans l'œil murin conduit à des pathologies rétiniennes spécifiques à la voie et pertinentes pour l'homme. En bref, l'expression induite par l'AAV du VEGF induit une fuite vasculaire et une néovascularisation. D'autre part, les cytokines pro-inflammatoires TNF-α et IL-6 ont toutes deux activé les cellules immunitaires. Le TNF-α a en outre entraîné une vascularite, une fibrose et le développement de membranes épirétiniennes fibrotiques.

Au cours des dernières années, les techniques de séquençage de nouvelle génération ont permis une étude détaillée des changements moléculaires dans les rétinopathies et ont permis de mieux comprendre la progression de la maladie chez les patients atteints de DMLA et de RD36,37,38. De même, le transcriptome de multiples modèles de rongeurs de rétinopathies a été séquencé et analysé39,40,41,42. Pour le modèle OIR, plusieurs études ont identifié des changements d'expression génique dépendants du point dans le temps liés à l'hypoxie, à l'angiogenèse et à l'inflammation43,44,45,46,47. Cependant, les comparaisons avec d'autres modèles murins de rétinopathies manquent encore. De plus, les approches modernes de séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-Seq) ont donné des informations sans précédent sur l'organisation cellulaire des tissus oculaires de mammifères sains et malades48,49,50,51,52,53,54. Plus en détail, Heng et al. démontré par séquençage unicellulaire de souris Aire-/-, un modèle d'uvéorétinite spontanée, qu'une population très diversifiée de cellules immunitaires envahit la rétine des souris Aire-/- et que les cellules Th1 représentent les principaux lymphocytes T effecteurs dans ce modèle, mettant en évidence la grand potentiel de ces approches de séquençage unicellulaire. À mesure que le nombre d'ensembles de données en vrac et unicellulaires disponibles dans le contexte des rétinopathies augmente, le potentiel d'intégration des données de divers modèles de rétinopathie et de les comparer au niveau moléculaire augmente également.

Dans cette étude, nous fournissons une analyse transcriptomique des AAV recombinants injectés par voie intravitréenne exprimant le VEGF humain, le TNF-α ou l'IL-6 chez la souris. Nous avons observé que l'expression médiée par l'AAV de transgènes humains introduisait des réponses transcriptomiques distinctes : alors que le TNF-α et l'IL6 affichaient des changements d'expression génique qui se chevauchaient, la surexpression du VEGF entraînait une réponse plus distincte par rapport au TNF-α et à l'IL-6. Plus en détail, en étudiant les voies affectées par chaque condition expérimentale, le VEGF a conduit à une régulation spécifique des gènes liés à la matrice extracellulaire (ECM), tandis que le TNF-α et l'IL-6 ont induit des changements dans la signalisation des interleukines. Nous avons en outre identifié des modifications spécifiques de l'expression génique associées au TNF-α qui comprenaient des molécules d'adhésion cellulaire, telles que Madcam1, et nous avons en outre démontré une régulation conservée de MAdCAM-1 par le TNF-α dans les cellules endothéliales rétiniennes humaines. En intégrant les données de séquençage d'ARN unicellulaire, nous avons pu montrer une augmentation des gènes spécifiques aux cellules T après l'expression du TNF-α et, en effet, l'invasion des cellules T médiée par le TNF-α a été validée par immunofluorescence. En plus d'évaluer les modifications du transcriptome dans les différents modèles de souris transgéniques, nous avons généré une évolution temporelle détaillée des modifications du transcriptome dans le modèle OIR établi. En comparant les modifications du transcriptome dans les modèles de surexpression de l'AAV et les souris OIR, nous avons observé le plus grand chevauchement entre les yeux traités par l'AAV-VEGF et la réponse tardive (P16) dans le modèle OIR, notamment les modifications de la voie ECM et des gènes marqueurs spécifiques des cellules endothéliales. En évidence, les changements spécifiques à l'OIR dans la régulation des gènes comprenaient des voies de signalisation neuronales qui n'ont pas été observées après l'expression du transgène AAV-VEGF. En conclusion, notre étude suggère que chaque modèle animal produit des profils d'expression génique distincts et qu'une sélection rigoureuse des modèles en fonction des exigences des différentes questions de recherche est nécessaire.

Pour étudier et comparer les profils transcriptomiques des tissus oculaires exprimant le VEGF, le TNF-α et l'IL-6 humains, nous avons injecté par voie intravitréenne des yeux de souris avec des AAV exprimant l'un des trois transgènes humains (Fig. 1a). Comme témoins, nous avons utilisé des yeux injectés de bourrage AAV à des concentrations correspondantes et des yeux non injectés. Notez que l'AAV-VEGF a été injecté à une dose virale plus faible (1 × 108 VG/œil), tandis que l'AAV-TNF-α et l'AAV-IL-6 ont été injectés à 1 × 109 VG/œil. Les yeux de tous les animaux ont été imagés in vivo directement avant la dissection des tissus et le séquençage de l'ARN pour valider les pathologies attendues et la gravité du phénotype. Conformément à notre étude publiée précédemment19, les injections de bourrage d'AAV n'ont pas induit de pathologies rétiniennes évidentes aux deux concentrations basées sur l'imagerie par autofluorescence bleue (BAF) (Fig. 1 supplémentaire), l'angiographie à la fluorescéine du fond d'œil (FFA, Fig. 2 supplémentaire) et Optical tomographie par cohérence (OCT, Fig. 3 supplémentaire), à ​​l'exception de quelques zones irrégulières plus claires ou plus sombres d'origine inconnue dans les images BAF. L'injection d'AAV-VEGF dans 3 échantillons sur 6 a entraîné une vascularisation élargie et en croissance anormale et une fuite vasculaire, comme le montrent les images FFA (Fig. 2 supplémentaire). Les yeux injectés d'AAV-TNF-α présentaient des infiltrats cellulaires dans le vitré, comme le montrent les scans OCT (Fig. 3 supplémentaire). Enfin, les yeux injectés d'AAV-IL-6 ont montré des foyers hyperfluorescents sous-rétiniens en imagerie BAF (Fig. 1 supplémentaire).

L'expression médiée par l'AAV du VEGF humain, du TNF-α ou de l'IL-6 entraîne des modifications distinctes du transcriptome. (a) Conception expérimentale : tissu de la rétine et de l'œilleton pour le séquençage de l'ARN de 6 groupes de traitement (non injecté, AAV-stuffer low, AAV-stuffer high, AAV-VEGF, AAV-TNF-α et AAV-IL-6) ont été prélevés 3 semaines après IVT et imagerie in vivo. L'image a été générée à l'aide de BioRender. ( b ) Expression spécifique des transgènes humains VEGF, TNF-α et IL-6 dans les groupes de traitement respectifs dans les tissus de la rétine et de l'œilleton (CPM: Counts Per Million). ( c ) L'hybridation in situ à l'aide de la technologie RNAscope a démontré l'expression des trois transgènes humains (flèches roses) dans le corps ciliaire (panneau supérieur) et la couche interne de la rétine centrale (panneau inférieur). Notez les cellules endothéliales anormales autour du corps ciliaire dans les yeux traités par AAV-VEGF (flèche noire) et les cellules immunitaires infiltrantes dans les yeux traités par AAV-TNF-α (flèche noire). ( d ) La PCA a démontré de grandes différences entre les tissus (panneau supérieur) et des changements spécifiques induits par le VEGF, le TNF-α et l'IL-6, respectivement, dans chaque tissu (panneaux inférieurs). Faible dose = 1 × 108 VG/œil ; Dose élevée = 1 × 109 VG/œil. Le pourcentage de variance expliqué par les deux premières composantes principales est indiqué avec les étiquettes x et y respectives.

Dans les six groupes de traitement, l'ARN total a été extrait de la rétine et de l'œilleton postérieur, y compris l'épithélium pigmentaire rétinien (RPE), la choroïde, la sclérotique et le corps ciliaire. Hormis deux échantillons qui ont été exclus en raison d'un faible numéro d'intégrité de l'ARN (RIN), six réplicats biologiques par groupe ont été séquencés. Les bibliothèques de séquençage ont été séquencées à une profondeur moyenne de 31,3 millions de lectures, avec 80,1 % de cartographie sur les transcrits d'ARNm et un faible contenu ribosomique (2,1 %), suggérant une bonne qualité globale des données de séquençage de l'ARN. Comme prévu, les transgènes humains ont montré une forte expression dans leurs groupes de traitement respectifs (Fig. 1b). Bien que la capside ShH10 utilisée dans cette étude soit décrite comme infectant principalement la glie de Müller55, nous avons remarqué des niveaux d'expression comparables de transgènes dans la rétine et dans l'œilleton, ce que nous avons confirmé pour le transgène VEGF par qRT-PCR (Fig. 4a supplémentaire). Pour identifier les principaux types de cellules transduites par la capside ShH10, nous avons effectué une hybridation in situ à l'aide de la technologie RNAscope sur des coupes histologiques d'yeux de souris injectés avec AAV-VEGF, AAV-TNF-α et AAV-IL-6 (Fig. 1c). Conformément à la littérature55, une expression forte et spécifique des transgènes était limitée à la partie interne de la rétine (probablement les cellules ganglionnaires rétiniennes et la glie de Müller). Étant donné qu'aucune coloration de l'ARNm n'a été observée dans les yeux traités avec le témoin AAV (Fig. 4b supplémentaire), nous avons conclu que les sondes utilisées pour détecter les trois transgènes respectifs étaient spécifiques. Dans l'œilleton, aucune expression de transgènes humains n'a été observée dans l'EPR ou le tissu choroïde, cependant, nous avons remarqué une forte expression dans le corps ciliaire, indiquant que l'expression génique mesurée par RNA-Seq dans les échantillons d'œilleton provenait du corps ciliaire (Fig. 1c).

L'analyse en composantes principales (ACP) a indiqué la plus grande variance dans l'expression des gènes entre les échantillons de rétine et d'œilleton (Fig. 1d, panneau de gauche). Dans le tissu rétinien, nous avons observé une séparation supplémentaire des échantillons entre les trois principaux groupes de traitement et les deux témoins de bourrage d'AAV ou les témoins non injectés (Fig. 1d, panneaux du milieu et de droite). Dans le PCA, des échantillons des trois groupes témoins sont apparus à proximité, ce qui ne suggère aucun changement majeur dans l'expression des gènes causé par l'injection IVT d'AAV en soi. En outre, les échantillons d'AAV-TNF-α et d'AAV-IL-6 se sont regroupés et ont affiché une bonne séparation des échantillons de contrôle à la fois dans le tissu de la rétine et de l'œilleton. Cependant, les échantillons d'AAV-TNF-α ont montré une séparation globale plus forte des témoins par rapport à l'AAV-IL-6. Dans le cas de l'AAV-VEGF, nous avons constaté que quatre des échantillons de rétine AAV-VEGF étaient clairement distincts des échantillons témoins et AAV-TNF-α / AAV-IL-6 (Fig. 1d). Cependant, les deux échantillons rétiniens restants (réplique 2 + 3) de souris traitées à l'AAV-VEGF n'ont montré aucune séparation des témoins dans les deux premiers composants principaux (Fig. 4c, d supplémentaires). Conformément à ces résultats, les deux réplicats 2 + 3 semblaient normaux sur la base du FFA (Fig. 2 supplémentaire; Fig. 4c supplémentaire), ce qui suggère que la transduction du virus peut avoir été insuffisante pour provoquer un phénotype. Comme nous avons en outre observé une expression réduite du VEGF humain dans les deux échantillons (Fig. 4c supplémentaire), nous avons retiré ces deux échantillons de toutes les analyses ultérieures.

Ensuite, nous avons étudié les gènes différentiellement exprimés (DE) dans les trois groupes de traitement AAV-VEGF, TNF-α et AAV-IL-6 par rapport à leur témoin AAV-stuffer respectif, ainsi que l'AAV-stuffer par rapport aux non injectés. témoins (tableau supplémentaire S1). Comme prévu, nous n'avons trouvé que peu de changements significatifs dans l'expression génique entre les échantillons injectés et non injectés de tampon AAV pour la rétine et l'œilleton (valeur p ajustée à la BH <0, 05; Fig. 2a), suggérant une fois de plus un impact limité de contrôle AAV injection sur l'expression des gènes. Nous avons observé le plus grand nombre de changements d'expression significatifs dans le tissu de l'œilleton transfecté par le TNF-α et l'IL-6, tandis que l'AAV-VEGF affectait principalement l'expression des gènes rétiniens, mais pas le tissu de l'œilleton. Dans chaque groupe de traitement, le transgène humain respectif figurait parmi les meilleurs gènes significativement régulés de manière différentielle au sein de leur groupe de traitement correspondant, validant une forte expression médiée par l'AAV à la fois dans la rétine et dans l'œilleton (Fig. 2b). Dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α, les molécules d'adhésion cellulaire telles que Vcam1 et Madcam1 et les chimiokines telles que Ccl2 figuraient parmi les gènes dérégulés les plus puissants, soutenant la fonction bien connue du TNF-α dans la régulation de l'adhésion des cellules immunitaires aux cellules endothéliales56. Pour confirmer les résultats du séquençage de l'ARN, l'expression de Ccl2 a été validée par qRT-PCR, qui a démontré des modèles d'expression similaires avec l'expression la plus élevée de Ccl2 trouvée dans les yeux traités à l'AAV-TNF-α (Fig. 4e, f supplémentaires). Notamment, le VEGF endogène a été régulé à la baisse dans les yeux traités par AAV-VEGF et le TNF-α endogène a été régulé à la hausse lors de l'expression médiée par l'AAV de TNF-α ou d'IL-6 (Fig. 5 supplémentaire).

L'analyse différentielle de l'expression génique a révélé des changements apparentés dans les yeux traités au TNF-α et à l'IL-6 par rapport au VEGF. ( a ) Nombre de gènes exprimés de manière différentielle dans chaque traitement par rapport à leurs témoins respectifs (valeur de p ajustée à la BH <0, 05). ( b ) Parcelles de volcan indiquant les principaux gènes régulés de manière différentielle dans la rétine et le tissu de l'œilleton lors de l'injection d'AAV-VEGF, d'AAV-TNF-α ou d'AAV-IL-6. ( c ) Diagrammes de Venn représentant des ensembles de gènes exprimés de manière différentielle se chevauchant entre les groupes de traitement. 820 gènes ont été spécifiquement régulés par l'AAV-VEGF. Grand chevauchement entre les gènes à régulation différentielle induits par le TNF-α et l'IL-6 dans la rétine et le tissu de l'œilleton. ( d ) La corrélation de Spearman a vérifié une forte corrélation entre les changements d'expression génique induits par le TNF-α et l'IL-6 dans la rétine et le tissu de l'œilleton. Le dendogramme montre un regroupement hiérarchique et donc une similarité des changements de pli induits par le traitement par rapport à leurs témoins respectifs.

Pour trouver des régulateurs communs des maladies rétiniennes, mais aussi identifier des voies spécifiques pouvant être corrélées aux phénotypes spécifiques induits par les trois transgènes exprimés, nous avons comparé les signatures transcriptomiques de l'AAV-VEGF, de l'AAV-TNF-α et de l'AAV-IL-6 ( figure 2c). Dans l'ensemble, dans le tissu rétinien, seuls 44 gènes étaient significativement régulés de manière différentielle dans les trois groupes de traitement par AAV. 820 gènes DE étaient spécifiques à la rétine traitée par AAV-VEGF, soulignant en outre une réponse transcriptionnelle différente dans AAV-VEGF par rapport à AAV-TNF-α et AAV-IL-6. Seuls 2 gènes étaient significativement régulés de manière différentielle dans le tissu de l'œilleton traité par AAV-VEGF, ce qui suggère que le VEGF affecte principalement les cellules rétiniennes dans le modèle présenté basé sur l'AAV. 1282 et 272 gènes étaient DE dans les rétines transduites par AAV-TNF-α et AAV-IL-6, respectivement, avec 133 gènes se chevauchant entre ces deux groupes. De plus, seuls 68 gènes étaient spécifiquement régulés par l'AAV-IL-6, mais 966 par le TNF-α dans la rétine, suggérant qu'une grande partie des changements d'expression génique induits par l'AAV-IL-6 étaient inclus dans l'AAV-TNF-α réponse. Conformément à ces résultats, la corrélation la plus élevée des changements de pli a été observée entre les profils d'expression traités par l'AAV-TNF-α et l'AAV-IL-6 dans la rétine et le tissu de l'œilleton, tandis que l'AAV-VEGF semblait plus distinct (Fig. 2d).

Ensuite, nous avons analysé les voies REACTOME significativement affectées (test hypergéométrique, valeur p ajustée BH < 0,01) par un traitement AAV-VEGF, AAV-TNF-α ou AAV-IL-6. Une seule voie a été enrichie dans la rétine des trois groupes de traitement (Fig. 3a), à savoir "Interactions de surface cellulaire au niveau de la paroi vasculaire" (Fig. 3b). Dans les rétines injectées par AAV-VEGF, la voie la plus dérégulée était "l'organisation de la matrice extracellulaire", tandis que l'AAV-TNF-α et l'AAV-IL-6 ont tous deux induit les changements d'expression génique les plus forts dans la voie "Interactions immunorégulatrices entre un lymphoïde et un cellule non lymphoïde". Parmi les voies spécifiques du VEGF dans la rétine, les voies liées aux "protéoglycanes ECM" et au collagène ont été significativement dérégulées. Au total, 29 voies ont été spécifiquement régulées dans le tissu rétinien injecté de TNF-α, par exemple la voie "Class A 1 Rhodopsin Like Receptors". Deux voies ont été enrichies spécifiquement dans les échantillons d'AAV-IL-6 : "Initial Triggering of Complement" et "Creation of C4 and C2 activators". Les voies régulées à la fois par le TNF-α et l'IL6 comprenaient la "signalisation par les interleukines" et la voie "Complement Cascade".

Le traitement AAV-VEGF a modifié les gènes liés à la MEC, tandis que AAV-TNF-α et AAV-IL-6 ont induit une forte réponse inflammatoire dans le tissu rétinien. ( a ) 33 voies étaient spécifiquement régulées par le VEGF dans la rétine et la majorité des voies régulées par l'IL-6 étaient également régulées par le TNF-α dans la rétine et le tissu de l'œilleton. (b) Toutes les voies REACTOME sont significativement enrichies (valeur de p ajustée à la BH < 0,01) dans au moins un des traitements (AAV-VEGF, AAV-TNF-α et AAV-IL-6).

Étant donné que seuls très peu de gènes étaient significativement régulés de manière différentielle dans le tissu de l'œilleton transduit par AAV-VEGF, seuls les traitements AAV-TNF-α et AAV-IL-6 ont été comparés dans le tissu de l'œilleton (Fig. 6 supplémentaire). Encore une fois, comme pour l'analyse différentielle de l'expression génique, la majorité des voies identifiées dans les yeux de l'AAV-IL-6 étaient partagées avec l'AAV-TNF-α dans les tissus de la rétine et de l'œilleton (Fig. 6b supplémentaire).

La voie de la cascade du complément est potentiellement impliquée dans la progression de la maladie pour diverses rétinopathies, dont la DMLA5. Nous avons donc analysé plus en détail les changements d'expression génique dans cette voie. En comparant les trois groupes de traitement dans les deux tissus, le nombre absolu le plus élevé de gènes DE associés à la voie REACTOME "Complement Cascade" a été observé dans le tissu de l'œilleton des yeux traités à l'AAV-TNF-α (Fig. 4a). Fait intéressant, les activateurs du complément C3, Cfp et Cfb étaient fortement régulés à la hausse dans l'AAV-TNF-α, tandis que les inhibiteurs du complément tels que Cfh ou Cfi n'étaient pas régulés dans l'AAV-TNF-α. En revanche, moins de gènes liés au complément étaient régulés par l'AAV-IL-6 et incluaient une forte régulation à la hausse de l'inhibiteur du complément Cfi, indiquant une activation nulle ou plus légère de la voie du complément par rapport à l'AAV-TNF-α. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent une activation de la voie du complément dans les yeux traités par AAV-TNF-α. L'un des gènes présentant la plus grande régulation à la hausse dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α était C3 dans la rétine et le tissu de l'œilleton (Fig. 4b). Pour valider nos résultats, nous avons mesuré l'expression de C3 par ELISA dans une cohorte de souris indépendante57 et vérifié la régulation à la hausse de la protéine C3 également 6 semaines après le traitement AAV-TNF-α (Fig. 4c). De plus, comme preuve de mécanisme, l'anticorps neutralisant le TNF-α, le golimumab, a réduit de manière significative la régulation à la hausse médiée par le TNF-α de C3 (Fig. 4c), démontrant que la régulation à la hausse de C3 dépend du TNF-α et peut être inversée dans notre modèle. .

Le TNF-α a induit une forte régulation à la hausse de la voie du complément (a) Une régulation à la hausse de plusieurs membres de la voie en cascade du complément a été observée en particulier dans le tissu de l'œilleton transduit par AAV-TNF-α. Les carrés colorés dans les colonnes de gauche indiquent des changements d'expression génique significatifs avec une valeur P ajustée BH <0,05. ( b ) L'expression de C3 était fortement régulée positivement dans la rétine et l'œilleton traités à l'AAV-TNF-α. ( c ) La protéine C3 a également été régulée positivement par AAV-TNF-α dans une cohorte de souris indépendante à 6 semaines après le traitement AAV-TNF-α et cette régulation positive a été partiellement sauvée par un traitement anti-TNF-α avec golimumab (** p <0, 01 ; *p < 0,05, ANOVA à 1 facteur avec test post-hoc de Tukey ; n = 3–6) tel que mesuré par ELISA.

Les interactions de surface des cellules intégrines faisaient partie des quelques voies qui changent de manière significative dans les groupes de traitement AAV-VEGF et AAV-TNF-α dans la rétine, nous nous sommes donc intéressés aux signatures d'expression génique communes ou différentes entre ces deux conditions. Dans la voie d'interaction de surface cellulaire de l'intégrine, nous avons observé 4 groupes différents : des gènes qui étaient régulés positivement de la même manière dans l'AAV-VEGF et l'AAV-TNF-α, régulés à la hausse spécifiques à l'AAV-VEGF, régulés à la baisse spécifiques à l'AAV-TNF-α et régulés dans AAV-TNF-α et AAV-IL-6 (Fig. 5a). Dans la rétine, plusieurs collagènes ont été régulés positivement spécifiquement dans les yeux traités par AAV-VEGF, tandis que AAV-TNF-α et AAV-IL-6 ont tous deux induit l'expression de gènes codant pour des sous-unités d'intégrine. Fait intéressant, les molécules d'adhésion cellulaire (CAM), telles que Icam1, Vcam1 et Madcam1, n'étaient fortement régulées à la hausse que dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α (Fig. 5a, b). Madcam1 a déjà été lié au TNF-α et est un acteur important dans le développement des maladies inflammatoires de l'intestin, mais seules quelques études décrivent Madcam1 dans le contexte des rétinopathies, contrairement à d'autres molécules d'adhésion comme Vcam1. Ainsi, pour tester si MAdCAM-1 peut également être pertinent pour les rétinopathies humaines, nous avons stimulé les cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes primaires humaines (HRMEC) avec du TNF-α humain recombinant. Remarquablement, la stimulation par le TNF-α a fortement augmenté l'expression de Madcam1 dans les HRMEC (Fig. 5c), suggérant que MAdCAM-1 pourrait également jouer un rôle important dans la rétine humaine et contribuer à la progression de diverses rétinopathies humaines.

Les molécules d'adhésion cellulaire, y compris Madcam-1, sont spécifiquement régulées positivement dans les yeux traités à l'AAV-TNF-α. (a) Un modèle d'expression génique spécifique au sein de la voie REACTOME "Integrin Cell Surface Interactions" a révélé une régulation à la hausse des gènes du collagène par l'AAV-VEGF. Les colonnes de gauche indiquent à nouveau un changement significatif de l'expression génique avec une valeur P ajustée à BH <0,05. Les membres de la famille des intégrines étaient principalement affectés par le traitement AAV-TNF-α et AAV-IL-6, mais pas AAV-VEGF. ( b ) Madcam1 était l'un des gènes les plus régulés positivement dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α dans la rétine et le tissu de l'œilleton. ( c ) L'expression de MADCAM1 humaine est régulée positivement par la stimulation par le TNF-α des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMEC, ** p <0, 01, test t non apparié, n = 3).

Comme les données d'ARN-Seq en vrac ne résolvent pas l'expression des gènes au niveau cellulaire, nous avons utilisé des études récemment publiées sur l'ARN-Seq de la rétine humaine et de l'EPR48,49,54 afin d'identifier les changements spécifiques au type de cellule induits par l'AAV. -VEGF, AAV-TNF-α et AAV-IL-6. À cette fin, nous avons identifié des gènes marqueurs spécifiques aux cellules pour différents types de cellules dans les ensembles de données scRNA-Seq des tissus de la rétine et de l'EPR et les avons comparés aux gènes exprimés de manière différentielle dans notre modèle de rétinopathie induite par l'AAV. Dans le cas des données Heng single cell RNA-Seq, nous avons combiné des échantillons de souris de type sauvage et de rétines Aire-/- de type uvéite pour mieux refléter tous les types de cellules présentes dans la rétine saine, mais aussi enflammée, semblable à notre AAV-TNF- Yeux traités avec α et AAV-IL-6. Conformément aux vasculopathies observées dans les yeux traités par AAV-VEGF, un enrichissement significatif (test hypergéométrique, valeur de p ajustée à la BH < 0,05) des gènes marqueurs spécifiques des cellules endothéliales et périvasculaires après traitement par AAV-VEGF a été observé (Fig. 6a , panneau de gauche). En revanche, les gènes spécifiques aux monocytes / macrophages se chevauchaient de manière significative avec les gènes DE de la rétine et du tissu de l'œilleton traités à la fois par l'AAV-TNF-α et l'AAV-IL-6 (Fig. 6a). Fait intéressant, l'enrichissement de ces cellules immunitaires était plus fort pour les yeux injectés d'AAV-TNF-α que pour les yeux injectés d'AAV-IL-6, correspondant à une inflammation plus sévère induite par l'AAV-TNF-α décrite précédemment19. Une analyse de suivi avec un deuxième ensemble de données scRNA-Seq49 disponible provenant de la rétine humaine et du tissu RPE a validé un enrichissement significatif des marqueurs spécifiques des macrophages/microglies dans les gènes DE dérivés de l'AAV-TNF-α et de l'AAV-IL-6, ainsi que le chevauchement entre les gènes endothéliaux marqueurs spécifiques au type de cellule et gènes DE identifiés dans les yeux traités par AAV-VEGF (Fig. 7a supplémentaire).

Les gènes marqueurs spécifiques des cellules endothéliales sont régulés positivement par le VEGF et les gènes spécifiques des cellules T par le TNF-α. ( a ) L'expression du VEGF a induit une régulation à la hausse des gènes marqueurs spécifiques des cellules endothéliales et périvasculaires dans le tissu rétinien. L'expression de TNF-α et d'IL-6 a induit un enrichissement en gènes spécifiques aux macrophages/monocytes. Seul le TNF-α a induit une régulation positive significative des gènes spécifiques aux cellules B et T dans la rétine. ( b ) La carte thermique des gènes spécifiques aux cellules T dérégulés de manière significative dans tout traitement a démontré une forte régulation à la hausse de ces gènes par l'AAV-TNF-α. ( c ) La coloration par immunofluorescence avec le marqueur pan-cellule T CD3 a révélé une infiltration de cellules T dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α (vert = CD3, bleu = DAPI). Notez l'épaisseur rétinienne accrue et la désorganisation des couches rétiniennes dans les yeux traités par AAV-TNF-α.

Les changements d'expression des gènes marqueurs spécifiques au type de cellule pertinents identifiés (cellules endothéliales vasculaires, monocytes) étaient pour la plupart positifs (Fig. 7b, c supplémentaires), suggérant une augmentation générale de ces types de cellules lors du traitement AAV respectif. Notre analyse d'enrichissement a en outre indiqué la plus forte régulation à la hausse des gènes marqueurs spécifiques des lymphocytes T dans les rétines TNF-α (Fig. 6a, b). Nous avons suivi cette observation par une analyse histologique de coupes transversales de la rétine, et avons en effet validé que des cellules exprimant le marqueur CD3 des cellules pan-T étaient présentes dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α (Fig. 6c), suggérant que les cellules T l'infiltration est induite par l'AAV-TNF-α.

Un modèle animal fréquemment utilisé pour les rétinopathies prolifératives est le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène (OIR), présentant à la fois une néovascularisation et une neurodégénérescence. Les souris néonatales sont exposées à 75 % d'oxygène du jour postnatal 7 au 12, puis retournent à l'air ambiant (21 % d'oxygène) jusqu'au jour 17. Au jour 7, le système vasculaire rétinien des souriceaux est encore immature et vulnérable aux conditions d'oxygène élevé. La perte de capillaires au centre de la rétine entraîne la formation d'une zone avasculaire. Lors du retour à l'air ambiant au jour 12, la zone devient hypoxique et il a été démontré que l'expression du VEGF dépendante de Hif1α déclenche l'angiogenèse, culminant à P1711,12. En raison de l'hypoxie, une apoptose des neurones et un amincissement de la rétine sont également observés dans la zone avasculaire de ce modèle58. Pour mieux comprendre les modifications du transcriptome induites par l'AAV-VEGF, le TNF-α et l'IL-6, nous avons cherché à comparer le transcriptome des rétines transduites par l'AAV aux rétines OIR. Tout d'abord, nous avons examiné les modifications du transcriptome induites dans le modèle OIR par rapport aux témoins au jour postnatal 12 (P12), P13, P14, P15 et P16. L'ACP a démontré une séparation claire entre le modèle OIR et les contrôles (Fig. 7a). Remarquablement, des changements dépendant du temps dans le transcriptome des souris témoins et OIR étaient clairement visibles dans le PCA (Fig. 7a). Le plus grand nombre de gènes exprimés de manière significativement différentielle (valeur de p ajustée à la BH <0, 05) a été détecté à P12 (10 855), peu de temps après le retrait des souris de la chambre hyperoxique (tableau supplémentaire S2). À des moments ultérieurs, le nombre de gènes exprimés de manière différentielle a diminué à environ 3 000 à 7 000 gènes entre P13 et P16 (Fig. 7b), suggérant une réponse transitoire directement après la fin du traitement hyperoxique (P12). Comme prévu, à partir de P13 au début de l'hypoxie dans la zone avasculaire, l'expression endogène du facteur Hif1a-dépendant de la souris Vegf a progressivement augmenté avec le temps (Fig. 8a supplémentaire), comme dans les études précédentes43,59. L'expression d'IL6 n'a pas été détectée, tandis que l'expression de TNF-α a culminé à P13 et 14 (Fig. 8b supplémentaire), suggérant une composante inflammatoire précoce dans le modèle OIR.

La signature transcriptomique du traitement AAV-VEGF est la plus similaire à celle observée chez les souris P16 OIR. ( a ) PCA a démontré une séparation claire des échantillons en fonction du traitement (normoxie vs hypoxie) et du moment. ( b ) Le plus grand nombre de changements d'expression génique a été observé à P12 et P13 et le nombre de gènes régulés de manière différentielle s'est stabilisé à 3 000 à 5 000 gènes à P14-P16. ( c ) L'enrichissement le plus fort pour un modèle d'expression génique similaire a été observé entre OIR P16 et AAV-VEGF (enrichissement de 2, 2 fois). ( d ) Le chevauchement entre les gènes DE de l'AAV-VEGF, de l'AAV-TNF-α, de l'AAV-IL6 et du modèle OIR (P16) est représenté dans le diagramme de Venn. ( e ) Les gènes spécifiquement exprimés par les cellules endothéliales ont été régulés positivement dans les yeux injectés d'AAV-VEGF et la rétine P15 / P16 OIR, mais pas la rétine P12 / P13 OIR.

Lors de la comparaison des trois modèles de souris AAV et OIR, nous avons observé un chevauchement significatif des gènes exprimés de manière différentielle (test hypergéométrique, valeur de p ajustée à la BH <0, 01) dans la rétine OIR par rapport à ceux identifiés dans le modèle AAV-VEGF (Fig. 7c, d). Le plus grand enrichissement des gènes DE a été trouvé entre les souris AAV-VEGF et le modèle OIR à P16, qui est le pic du phénotype vasculaire dans le modèle OIR. L'intégration des ensembles de données de cellule unique décrits précédemment 48, 54 a démontré que, entre autres, des gènes marqueurs spécifiques aux cellules vasculaires étaient également enrichis dans l'ensemble de données OIR (Fig. 8c supplémentaire) similaire aux données AAV-VEGF. Remarquablement, la majorité des gènes spécifiques aux cellules endothéliales étaient initialement régulés à la baisse dans les premiers moments de l'OIR, puis régulés à la hausse à partir de P15, de la même manière que l'AAV-VEGF (Fig. 7e). En revanche, les gènes DE identifiés à partir du modèle de souris OIR de stade avancé, mais pas ceux identifiés à partir de l'AAV-VEGF, se chevauchent de manière significative avec des gènes spécifiquement exprimés dans les cellules bipolaires. Nous avons conclu que les types de cellules endothéliales périvasculaires et vasculaires sont affectés par le traitement AAV-VEGF (Fig. 6a) et que d'autres types de cellules sont affectés dans le modèle OIR en raison de la malnutrition et de l'ischémie induites dans ce modèle.

Enfin, nous avons cherché à comprendre quelles voies étaient affectées dans les modèles de rétinopathie pilotés par AAV-VEGF par rapport au modèle OIR (Fig. 8d supplémentaire). Fait intéressant, plusieurs voies liées à la matrice extracellulaire ont été enrichies en gènes DE identifiés à partir du modèle AAV-VEGF ou du modèle OIR, suggérant des changements similaires dans les deux modèles. Une fois de plus, "l'organisation de la matrice extracellulaire" est apparue comme l'une des voies les plus dérégulées à la fois dans l'AAV-VEGF mais aussi dans l'OIR P16. Fait intéressant, les gènes liés à la signalisation neuronale ont été enrichis parmi les voies spécifiques à l'OIR, tandis que les voies spécifiques à l'AAV-VEGF comprenaient des voies impliquées dans les interactions de surface cellulaire. Dans l'ensemble, notre analyse a révélé des similitudes mais aussi des différences entre les quatre modèles de souris différents pour les rétinopathies et constitue donc une ressource précieuse pour les chercheurs afin d'identifier le modèle animal le plus approprié par rapport à leur sujet de recherche préclinique.

Dans cette étude, nous avons mesuré les changements de transcriptome induits par AAV-VEGF, AAV-TNF-α et AAV-IL-6 et comparé ces changements d'expression entre eux et avec les changements d'expression génique observés dans le modèle OIR bien établi. Notre objectif était de mieux comprendre les mécanismes moléculaires potentiels contribuant aux pathologies rétiniennes, mais aussi d'augmenter notre capacité à sélectionner les modèles animaux appropriés pour chaque pathologie.

Les AAV sont apparus comme un outil utile pour générer rapidement de nouveaux modèles animaux qui permettent un degré élevé de flexibilité en ce qui concerne le moment et l'expression spécifique aux tissus. Dans notre étude, nous avons choisi la capside ShH10 pour l'expression des trois transgènes humains. Même à l'échelle mondiale, mesurée via une méthode à haut débit telle que RNA-Seq, l'injection de la capside témoin (1 × 108 ou 1 × 109 VG/œil) dans les yeux de souris avec une séquence biologiquement inactive, a produit très peu d'expression génique changements. L'expression médiée par l'AAV de hTNF-α, hIL-6 ou hVEGF a conduit à une expression élevée de ces transgènes humains, qui à son tour a produit des changements de transcriptome forts et distincts. Bien que des erreurs de mesure dans l'ARN-Seq causées par la présence simultanée de versions humaines et murines du transgène exprimé par l'AAV soient théoriquement possibles, nous ne nous attendons pas à une grande erreur de quantification, puisque les transgènes humains sont optimisés en codons et possèdent une étiquette V5, ils sont donc suffisamment dissemblables à leur séquence de transcription endogène. De plus, nous n'avons observé aucune réduction du pourcentage de lectures cartographiées de manière unique en présence de transgènes exprimés par l'AAV (données non présentées).

Selon la littérature actuelle, ShH10 infecte principalement la glie de Müller55, qui couvre anatomiquement la rétine complète avec leurs processus, permettant ainsi la sécrétion de VEGF, TNF-α et IL-6 dans toute la rétine. L'analyse RNAscope a indiqué l'expression de transgènes humains dans la couche RGC et la couche nucléaire interne, dérivant potentiellement de la glie de Müller. De plus, l'analyse RNAscope a en outre démontré une forte expression des trois transgènes dans le corps ciliaire, expliquant pourquoi des niveaux d'expression élevés des transgènes ont été détectés dans l'analyse ARN-Seq du tissu disséqué de l'œilleton, y compris le corps ciliaire. Une forte expression de transgènes humains dans le corps ciliaire pourrait également expliquer la croissance du tissu endothélial autour du corps ciliaire dans les zones rétiniennes périphériques dans les yeux injectés d'AAV-VEGF19. Fait intéressant, dans l'article original décrivant la capside ShH10, l'injection IVT de ShH10-GFP a conduit à une forte expression de GFP dans la glie de Müller ainsi que dans le corps ciliaire, mais cette découverte n'a pas été discutée plus avant55. Pendant ce temps, d'autres chercheurs ont étudié les capsides AAV avec une bonne efficacité de transduction du corps ciliaire pour le traitement du glaucome et ont trouvé la capside ShH10 la plus appropriée pour transduire le corps ciliaire par rapport aux capsides AAV1, AAV2, AA5 et AAV660. Bien que la transduction du corps ciliaire puisse être souhaitable pour certaines applications, une expression strictement spécifique au type cellulaire peut être nécessaire, par exemple pour des approches de thérapie génique délivrant des protéines intracellulaires. Pour les facteurs sécrétés, tels que le VEGF, le TNF-α et l'IL-6, l'expression spécifique au type de cellule peut ne pas être nécessaire. Cependant, il sera toujours intéressant à l'avenir de tester d'autres capsides pour exprimer le VEGF, le TNF-α et l'IL-6 dans la rétine et de comparer les phénotypes obtenus par différents tropismes cellulaires. Ainsi, nous concluons qu'une sélection rigoureuse de la capside doit être effectuée pour chaque application.

Dans notre analyse, les gènes significativement changeants présents dans la cascade du complément étaient fortement et spécifiquement régulés positivement dans les yeux injectés avec AAV-TNF-α. Parmi eux, le facteur C3 de la voie du complément était l'un des gènes les plus fortement régulés positivement dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α. C3 joue un rôle central dans l'activation de la voie classique et alternative du complément et les mutations de C3 et d'autres membres de la cascade du complément sont corrélées à un risque plus élevé de DMLA61,62,63 et d'uvéite64. De plus, on sait que C3 est régulé positivement dans la rétine des patients atteints de DMLA65,66, ainsi que dans le vitré, l'eau et le sérum des patients atteints d'uvéite67,68,69, ainsi, le ciblage du système du complément présente une approche intéressante pour traiter les rétinopathies70. Par conséquent, les traitements anti-C3 et anti-C5 sont actuellement évalués dans des essais cliniques de stade avancé pour l'atrophie géographique (AG) secondaire à la DMLA71,72. Dans le passé, les animaux transgéniques modifiant l'expression des gènes du complément, ou les souris exprimant des variantes humaines des gènes liés au complément, se sont avérés extrêmement utiles pour comprendre leur contribution à la progression de la maladie65,73,74,75,76,77,78. Pour développer davantage des thérapies nouvelles et efficaces, des modèles animaux avec une activation robuste de la voie du complément sont nécessaires. Dans le modèle d'uvéite induite par le LPS, les gènes liés au complément, y compris C3, sont régulés positivement39, suggérant une activation du complément. De même, l'uvéite auto-immune expérimentale (EAU) conduit à l'activation du système du complément et le blocage du système du complément améliore la pathologie de la maladie79. L'activation du système du complément est également visible dans le modèle de néovascularisation choroïdienne induite par laser (NVC), et l'inhibition de divers facteurs du complément a eu des effets bénéfiques80,81,82. Cependant, les modèles expérimentaux d'uvéite et le modèle laser CNV sont transitoires et ne permettent que des investigations à court terme. En revanche, dans le modèle AAV-TNF-α présenté, C3 a montré une régulation positive forte et soutenue à 3 et 6 semaines après l'injection IVT d'AAV-TNF-α, permettant ainsi des études à long terme du système du complément. De plus, comme preuve de mécanisme, nous avons montré que le traitement avec l'anticorps neutralisant TNF-α golimumab réduit l'expression de C3, démontrant que l'activation du complément est réversible dans notre modèle. En résumé, le modèle de souris induit par l'AAV-TNF-α fournit un outil précieux pour étudier le rôle du système du complément dans la progression de la maladie, avec une expression à long terme du TNF-α et du C3, comparable à la pathologie humaine qui se développe au fil des décennies. .

En plus de C3, les molécules d'adhésion cellulaire (CAM), telles que Icam1, Vcam1 et Madcam1 ont été fortement régulées positivement dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α, renforçant l'observation précédente d'infiltration de cellules immunitaires et de vascularite dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α par histologie19. MAdCAM-1 est induite par le TNF-α dans diverses cellules endothéliales et recrute des lymphocytes T dans les tissus enflammés83,84,85 et, par conséquent, a récemment été identifiée comme une cible intéressante pour traiter les maladies inflammatoires de l'intestin86. En plus de la régulation à la hausse de Madcam1, nous avons observé une infiltration de lymphocytes T dans notre modèle de type uvéite piloté par AAV-TNF-α, conformément au rôle bien décrit des lymphocytes T chez les patients atteints d'uvéite et les modèles de rongeurs d'uvéite87,88. Bien qu'il existe un intérêt général pour le rôle du TNF-α et des CAM dans le cadre des rétinopathies, il n'existe à notre connaissance qu'une seule étude récente de Peng et al. démontrant une fonction directe pour Madcam1 murin dans la dégénérescence rétinienne83. Conformément à Peng et al., nous avons démontré une régulation à la hausse de Madcam1 dans les yeux injectés d'AAV-TNF-α en corrélation avec une invasion de lymphocytes T. En développant cette observation, nous avons démontré que MAdCAM-1 est également régulée positivement dans les HRMEC stimulées par le TNF-α, ce qui suggère que la régulation induite par le TNF-α de MAdCAM-1 peut également être pertinente dans les cellules rétiniennes humaines.

Afin de mieux comprendre les différences entre divers modèles de maladie de rétinopathie, nous avons comparé les profils d'expression génique des modèles de rétinopathie générés par l'AAV aux données RNASeq du modèle OIR fréquemment utilisé11,12. Pour capturer la dynamique d'expression transitoire présente dans le modèle OIR, nous avons collecté des yeux de souris à 5 moments ultérieurs après le traitement hyperoxique. En effet, d'autres auteurs ont effectué une analyse de l'expression du gène OIR, cependant, de nombreuses études se sont appuyées sur des données de puces à ADN évaluant uniquement une partie du transcriptome contrairement à l'ensemble de l'analyse du transcriptome présentée ici. D'autre part, les études OIR RNA-Seq comprenaient un échantillonnage moins dense des points temporels par rapport à notre étude, dans laquelle nous fournissons des informations plus détaillées sur les changements d'expression génique en fonction du temps. L'étude de Yang et al.46 s'est concentrée sur les changements d'expression génique pendant et peu après le traitement hyperoxique, tandis que notre étude s'est principalement intéressée aux changements d'expression génique après le retour aux conditions normoxiques et à une comparaison détaillée avec les changements d'expression génique induits par l'AAV. Néanmoins, nous avons observé des signatures d'expression génique partagées de gènes clés entre les deux études, par exemple le VEGF et le gène Edn2 étaient tous deux régulés positivement à P13.

Il est bien connu que le VEGF est un moteur majeur du modèle OIR et que le traitement anti-VEGF empêche la néovascularisation dans le modèle OIR17,24. Ainsi, comme prévu, les gènes DE dans le modèle AAV-VEGF ont montré le plus grand chevauchement avec ceux identifiés dans le modèle OIR. En intégrant les données d'expression d'ARN-Seq unicellulaires, nous avons montré que dans le temps mesuré pour le modèle OIR, les gènes spécifiques aux cellules endothéliales étaient d'abord régulés à la baisse, puis régulés à la hausse à partir de P15. D'autres études ont également trouvé une régulation négative des gènes liés à l'angiogenèse tels que CD34 dans le modèle OIR à P12, tandis que des gènes spécifiques aux cellules endothéliales tels que Esm1 ou Edn2 étaient régulés positivement à P1789. Esm1 est un gène bien connu induit par le VEGF dans les cellules de pointe avec un rôle crucial dans l'angiogenèse et son blocage inhibe la néovascularisation de divers modèles de néovascularisation chez les rongeurs, y compris l'OIR, le laser CNV et la souris transgénique rho/VEGF. En conséquence, nous avons également observé une régulation à la hausse du gène Esm1 à la fois dans l'ensemble de données OIR mais aussi dans le modèle piloté par AAV-VEGF, ressemblant très bien au phénotype de néovascularisation observé. Étant donné que nous fournissons une résolution temporelle élevée des changements d'expression génique dans le modèle OIR, nous avons pu identifier le passage entre la régulation à la baisse et à la hausse des gènes spécifiques aux cellules endothéliales vers P14. Ces changements d'expression génique correspondent très bien aux changements phénotypiques présents dans le modèle OIR, où à P12 le développement de la vascularisation est altéré et des zones avasculaires sont présentes, et plus tard, des pics de néovascularisation à environ P1792,93.

Bien que de nombreuses voies, y compris les voies liées à l'ECM et les réponses spécifiques aux cellules endothéliales, étaient similaires entre le modèle OIR et les souris traitées par AAV-VEGF, nous avons également observé des différences entre ces modèles de maladie : par exemple, dans le modèle OIR, mais pas AAV-VEGF, les voies de signalisation neuronales et les gènes liés aux synapses ont été significativement enrichis pour les gènes DE. Conformément à cette observation, nous avons observé un chevauchement significatif des gènes spécifiques aux cellules neuronales (par exemple, les cellules bipolaires, les RGC) et les gènes DE identifiés dans le modèle OIR. Pour le modèle OIR, des chiots âgés de P12 à P17 sont utilisés, un moment qui correspond à un moment où les réseaux vasculaires et neuronaux se développent encore dans la rétine murine94,95. De plus, la mort neuronale et la diminution de la fonction rétinienne ont été observées dans le modèle OIR96,97, probablement en raison de l'ischémie et de la malnutrition induites par l'hypoxie. En conséquence, le modèle OIR a été considéré comme le modèle le plus approprié pour la rétinopathie du prématuré (ROP)93, une maladie affectant les prématurés humains. Alors que de très jeunes souriceaux sont nécessaires pour le modèle OIR, des souris âgées ou diabétiques peuvent être combinées à la surexpression d'AAV de transgènes humains, pour refléter plus étroitement les rétinopathies humaines liées à l'âge ou associées au diabète telles que la DMLA ou la RD à l'avenir.

Malgré nos efforts pour assurer une conception expérimentale optimale, certaines limites s'appliquent, notamment que les ensembles de données de séquençage AAV et OIR ont été générés dans des expériences indépendantes. De plus, également d'un point de vue biologique, les modèles diffèrent, puisque le modèle OIR utilise de très jeunes souriceaux au cours du développement, contrairement à nos modèles induits par l'AAV qui ont été développés à l'aide de souris adultes. Alors que dans l'étude OIR, 3 ou 4 échantillons étaient inclus à chaque instant, l'étude AAV a été réalisée avec 5 ou 6 répétitions par groupe. De plus, la préparation et le séquençage de la bibliothèque dépendaient de différents protocoles. Pour atténuer ces limitations, notre analyse est basée sur des changements de pli relatifs entre le traitement et les contrôles respectifs, plutôt que sur des valeurs d'expression absolues, ce qui explique les différences dans la préparation de la bibliothèque.

Au total, nous avons caractérisé ici les profils d'expression génique des modèles de souris de rétinopathie pilotée par AAV-VEGF, TNF-α ou IL-6, et combiné ces mesures avec des données d'expression d'ARN à cellule unique accessibles au public. Notre étude donne un aperçu unique des changements moléculaires et spécifiques aux cellules conduisant aux pathologies rétiniennes, découvrant ainsi de nouvelles options de traitement potentielles pour les maladies rétiniennes, et offrant en même temps les moyens de les tester dans un modèle de maladie stable comparable à la pathologie humaine. En mesurant davantage les changements d'expression génique dans le modèle OIR bien établi, nous avons comparé des modèles animaux nouveaux et établis pour les rétinopathies et fournissons aux chercheurs des informations importantes guidant la décision dont le modèle animal convient le mieux au besoin d'un projet de recherche préclinique donné.

Des souris C57BL/6 J ont été achetées chez Charles River (Sulzfeld, Allemagne). Des souris mâles âgées de 6 à 8 semaines ont été utilisées pour l'étude AAV. Des femelles gestantes ont été achetées pour l'étude OIR et des chiots mâles et femelles à P12 ont été utilisés pour les expériences OIR. Les souris ont été logées dans des cages ventilées individuellement par groupes de 2 à 5, à température constante et avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Les souris avaient accès ad libitum à de la nourriture standard pour rongeurs et à de l'eau. Les expérimentations animales ont été réalisées conformément à la loi allemande sur le bien-être animal, aux directives de la Fédération de l'Association européenne des sciences animales de laboratoire (FELASA), aux directives ARRIVE et ont été examinées et approuvées par l'organisme gouvernemental responsable du bien-être animal dans l'état de Baden Wurtemberg (Regierungspräsidium Tübingen, Allemagne).

Des plasmides avec le promoteur CAG ubiquitaire ont été générés codant pour trois transgènes humains optimisés en codons (VEGF-A 165, TNF-α et IL-6) qui ont une séquence V5-tag à l'extrémité 3 'du gène ont été générés précédemment19. La construction de contrôle AAV-stuffer comprend une séquence non codante de l'UTR 3' du gène UBE3A et a été décrite ailleurs (Strobel 2015). Les AAV utilisés dans cette étude ont été emballés dans la capside ShH10 (Klimczak 2009). La production et la quantification d'AAV par PCR quantitative ont été effectuées selon des protocoles précédemment publiés (Strobel 2019). Les séquences humaines optimisées en codons suivantes ont été incluses dans chacun des AAV recombinants :

AAV-hIL6—.

AAV-hTNFa—.

AAV-hVEGF—.

Les souris ont reçu une injection intravitréenne des différents AAV sous anesthésie à l'isoflurane et après l'application de gouttes oculaires anesthésiques locales (Novesin, OmniVision). Les deux yeux de 6 souris par groupe ont reçu une injection de 1 × 108 génomes viraux (VG)/œil (faible dose) ou de 1 × 109 VG/œil (dose élevée) dans 1 µL de tampon AAV. Notez que l'AAV-VEGF a été injecté à une concentration de 1 × 108 VG/œil et l'AAV-TNF-α et l'AAV-IL-6 à 1 × 109 VG/œil avec des témoins AAV-stuffer correspondants. Dans une cohorte indépendante de souris, 2 semaines après le traitement AAV-TNF-α, les yeux ont reçu une injection IVT de 1 µL de véhicule ou de Golimumab anti-TNF-α neutralisant (100 mg/mL, Simponi, 4 223 913, Komtur Apotheke). Si l'injection IVT échouait (par exemple en raison d'une lésion d'un gros vaisseau sanguin ou du cristallin), l'œil était exclu de l'analyse.

L'imagerie in vivo a été réalisée comme décrit précédemment19. En bref, des souris ont été anesthésiées par injection intrapéritonéale avec 60 à 90 mg/kg de kétamine (Medistar) et 6 à 8 mg/kg de xylazine (Rompun, Bayer). Les pupilles ont été dilatées avec 5 mg/mL de tropicamide (Mydrum, Bausch + Lomb) et de phényléphrine (Neosynéphrine-POS 10 %, Ursapharm). Un appareil Spectralis HRA/OCT (Heidelberg Engineering) équipé d'un objectif à champ large de 55° a été utilisé pour l'enregistrement d'images de tomographie par cohérence optique (OCT) et d'images d'autofluorescence (AF). Pour l'angiographie à la fluorescéine du fond d'œil (FFA), 200 µL d'une solution de fluorescéine à 0,2 % (Alcon) ont été injectés par voie sous-cutanée et enregistrés 90 s après l'injection avec le Spectralis HRA/OCT (Heidelberg Engineering). Les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale. La rétine et l'œilleton (y compris l'EPR, la choroïde, la sclérotique et le corps ciliaire) ont été disséqués et congelés instantanément dans de l'azote liquide.

Les expériences OIR ont été réalisées selon des protocoles publiés précédemment (Smith et al.11). En bref, des chiots mâles et femelles âgés de 7 jours avec leurs mères ont été transférés dans une chambre hyperoxique (75% d'oxygène). À P12, la concentration d'oxygène a été lentement réduite à des conditions normoxiques (21 % d'oxygène) en environ 3 h. Les souris témoins sont restées dans des conditions normoxiques pendant toute l'expérience. Les souris ont été euthanasiées à P12, P13, P14, P15 et P16 par dislocation cervicale. Les rétines disséquées ont été stockées dans du RNAlater (Invitrogen).

Des tissus de rétine et d'œilleton disséqués surgelés (n = 72) ont été homogénéisés dans 700 µL de Qiazol (Qiagen) à l'aide d'un homogénéisateur Precellys Evolution (Bertin Technologies). Des échantillons de rétine ont été homogénéisés par des billes de céramique (MPbio, 6913-500) et des échantillons d'œilleton par des billes de métal (Bertin Technologies, 15 987 602) et traités en 4 lots séparés. L'ARN total a été extrait à l'aide du kit miRNeasy Micro (Qiagen, 217 084) selon le protocole tissulaire du fabricant, y compris le traitement à la DNase sur colonne (Qiagen, 79 254). Les échantillons d'ARN totaux (36 oculaires, 36 rétines) ont été évalués quantitativement et qualitativement à l'aide du kit d'analyse d'ARN Quant-iT à large plage de fluorescence (Thermo Fisher Scientific) et du kit d'analyse d'ARN à sensibilité standard DNF-471 sur un fragment à 96 canaux. Analyseur (Agilent), respectivement. Les concentrations étaient en moyenne de 48,7 ng/µL tandis que le RIN variait de 5,2 à 9,6, avec une médiane à 9,2. Deux échantillons avec un RIN inférieur à 6 ont été exclus du traitement en aval : réplicat 4 de l'œilleton AAV-stuffer (élevé) et réplique 5 de l'œilleton AAV-VEGF. Voir le tableau 1 pour un résumé de tous les échantillons de l'étude AAV.

Les rétines ont été disséquées chez des souris C57BL/6 J postnatales de 12 à 16 jours (n = 32). Les tissus conservés à l'ARNlater ont été rompus et homogénéisés dans des tubes CK14 (VWR, 10144-496) avec un tampon RLT à l'aide d'un homogénéisateur Precellys Evolution (Bertin Technologies). L'ARN total a ensuite été extrait à l'aide du kit d'isolement d'ARN total MagMAX-96 (Thermo Fisher Scientific, AM1830) comprenant une digestion à la DNase avant l'élution finale (Qiagen, 79254). Les échantillons d'ARN total ont été évalués quantitativement et qualitativement sur un lecteur de microplaques Synergy avec un module Gen5 Take3 (BioTek) et la puce microfluidique Eukaryote total RNA 6000 Nano (Agilent, 5067-1511) sur un système 2100 Bioanalyzer (Agilent), respectivement. Les concentrations moyennes étaient de 136,3 ng/µL tandis que le RIN des échantillons sélectionnés était supérieur à 8,4. Tous les échantillons ont ensuite été traités pour la préparation de la bibliothèque. Voir le tableau 2 pour un résumé de tous les échantillons de l'étude OIR.

70 échantillons d'ARN dérivés de la rétine et de l'œilleton ont été normalisés sur la plate-forme liquide automatisée MicroLab STAR (Hamilton). Un apport total d'ARN de 250 ng a été utilisé pour la construction de la bibliothèque avec le kit de préparation de bibliothèque d'ARN directionnel NEBNext Ultra II pour Illumina #E7760, avec le module d'isolation magnétique d'ARNm NEBNext Poly(A) #E7490 en amont et le NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina #E7600 en aval (tous les Biolabs de la Nouvelle-Angleterre). Le seul écart par rapport au protocole du fabricant était l'utilisation de billes Ampure XP (Beckman Coulter) pour la purification d'ADNc double brin, au lieu des billes SPRIselect recommandées. La PCR d'index a été réalisée avec 12 cycles, tandis que la bibliothèque finale a été éluée dans 35 µL. Les bibliothèques d'ARNm ont ensuite été quantifiées par le kit de dosage High Sensitivity dsDNA Quanti-iT (ThermoFisher) sur un Synergy HTX (BioTek). La molarité de la bibliothèque était en moyenne de 149 nM. Les bibliothèques d'ARNm ont également été évaluées pour la distribution de taille (analyse de frottis de 360 ​​bp en moyenne) et la présence de dimères adaptateurs (< 0,5 %) par le kit DNF-477 High Sensitivity Small Fragment sur un analyseur de fragments à 96 canaux (Agilent). Les 70 bibliothèques de séquençage ont ensuite été normalisées sur le MicroLab STAR (Hamilton), regroupées et enrichies avec PhiX Control v3 (Illumina). Le pool de bibliothèques a ensuite été regroupé sur une Flow Cell S4 et séquencé sur un système de séquençage NovaSeq 6000 (Illumina) avec un double indice, des lectures appariées à une longueur de 2 × 100 pb (paramètres de lecture : Rd1 : 101, Rd2 : 8, Rd3 : 8, Rd4 : 101), atteignant une profondeur moyenne de 31,3 millions de lectures Pass-Filter par échantillon (CV de 7,0 %). La description de la préparation et du séquençage de la bibliothèque d'ARN s'aligne étroitement sur celle donnée dans Becker et al.36.

Un apport total d'ARN de 100 ng a été utilisé pour la construction de la bibliothèque avec le kit TruSeq Stranded mRNA LT - Set A (Illumina, RS-122-2101), avec la SuperScript II Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific, 18064014), selon les instructions du fabricant. protocole. La qualité des bibliothèques d'ARNm a été évaluée pour la présence d'adaptateurs et d'hétérodimères à l'aide de la puce microfluidique DNA 1000 (Agilent, 5067-1504), tandis que la molarité de la bibliothèque a été mesurée à l'aide du kit d'analyse Quant-iT PicoGreen dsDNA (Invitrogen, P11496). Les 32 bibliothèques de séquençage ont ensuite été normalisées, regroupées et enrichies avec PhiX Control v3 (Illumina). Le pool de bibliothèques a ensuite été regroupé à l'aide du kit TruSeq SR Cluster Kit v3 (Illumina, GD-401-3001) et séquencé avec les réactifs TruSeq SBS Kit v3 (Illumina, FC-401-3002) sur un système de séquençage HiSeq 2000 (Illumina) avec index unique, lectures à lecture unique à une longueur de 1 × 51 pb (paramètres de lecture : Rd1 : 52, Rd2 : 7), atteignant une profondeur moyenne de 24,9 millions de lectures Pass-Filter par échantillon (CV de 13,1 %).

Des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines primaires (HRMEC, ACBRI 181, Cell Systems Corporation) ont été cultivées dans du milieu de croissance de cellules endothéliales (C-22010, Promocell) sur des plaques pré-enduites de gélatine à 0, 1% (ES-006-B, Millipore). Les cellules ont été cultivées dans une chambre humidifiée à 37°C et 5% de CO2. Le compteur de cellules LUNA-FL (LogosBio) avec le colorant Acridine Orange (F23002, LogosBio) a été utilisé pour la quantification des cellules avant l'ensemencement. Les HRMEC ont été stimulées avec 10 ng/mL de TNF-α humain recombinant (210-TA-005, RnD Systems) pendant 24 h à 37 °C. Les cellules ont été lavées avec du PBS et lysées dans du tampon RLT fourni par Qiagen et l'ARN a été extrait à l'aide du kit RNeasy Mini (74106, Qiagen) conformément au manuel du fabricant.

La synthèse d'ADNc a été effectuée à l'aide du kit d'ADNc haute capacité (4368814, Applied Biosystems) et la qRT-PCR a été réalisée avec le Taqman Universal PCR Master Mix (4304437, Applied Biosystems) sur un système de PCR en temps réel QuantStudio 6 (Applied Biosystems). L'expression relative (pli d'induction) a été calculée à l'aide de la méthode ΔΔCT et les gènes 18S (pour le tissu de souris) et POLR2A (pour les HRMEC) ont été utilisés comme contrôles de normalisation. Les sondes Taqman suivantes ont été utilisées dans cette étude: 18S (HS99999901_S1), POLR2A (HS00172187_M1), MADCAM1 (HS00369968_M1), CCL2 (MM00441242_M1) et un TABE de détection Taqman de Taqman (MM0041242_ - ACTGAACGAGAGAACCTGCA -3ʹ, amorce rev 5ʹ GCCCAGCAGAGGATTAGGAA-3ʹ, sonde 5ʹ- CTAGAAGAGGTGCG-3ʹ).

Les yeux pour la validation de l'expression de C3 ont été générés à partir d'une cohorte de souris indépendante publiée ailleurs57. En bref, 2 semaines après l'injection IVT d'AAV-TNF-α, 100 µg de golimumab (Simponi) ont été injectés par voie intravitréenne. 6 semaines après l'injection d'AAV, les yeux entiers ont été énucléés, congelés dans de l'azote liquide et homogénéisés dans un tampon de lyse (9803, Cell Signalling) additionné d'un inhibiteur de protéinase Pefabloc SC (76307-100MG, Sigma) avec des billes métalliques (15987602, Bertin Technologies) dans un homogénéisateur de tissus Precellys Evolution (Bertin Technologies). L'expression de C3 a été mesurée avec le kit ELISA Mouse C3 SimpleStep (ab26388, Abcam) selon le protocole du fabricant et mesurée avec un lecteur de plaques SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices).

Les yeux pour l'analyse histologique ont été générés dans une expérience indépendante qui a été publiée ailleurs19. Les yeux ont été énucléés 3 à 6 semaines après l'injection IVT et directement fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % (AR1068, Boster) pendant 48 h à 4 °C. Les yeux ont été déshydratés, incubés dans du xylol et infiltrés de paraffine à l'aide d'une machine de traitement des tissus (Tissue-Tek VIP 6, Sakura). Des colorations immunohistochimiques ont été réalisées sur des coupes de 3 µm avec le kit Opal Multiplex IHC (Akoya Biosciences) et réalisées sur la plateforme automatisée Leica Bond (Leica Biosystems, Melbourne, Australie). La récupération de l'antigène a été effectuée avec la BOND Epitope Retrieval Solution 1 (35608, Leica Biosystems, Melbourne, Australie) à 95 ° C et pH 6, 0 pendant 20 min. L'anticorps anti-CD3 polyclonal de lapin (ab5690, Abcam) a été dilué au 1:200 et utilisé comme marqueur pan-cellules T. L'anticorps secondaire polymère OPAL anti-lapin-HRP (ARR1001KT, Akoya Biosciences) et le réactif OPAL 570 (FP1488001KT, Akoya Biosciences) ont été utilisés pour développer le signal fluorescent. Les noyaux ont été colorés avec du DAPI spectral (FP1490, Akoya Biosciences) et les lames ont été montées avec du milieu de montage ProLong Antifade (P36961, Invitrogen). Les colorations par immunofluorescence ont été imagées à l'aide d'un microscope à balayage laser LSM700 (objectif 20 ×, Carl Zeiss Microscopy GmbH). Les hybridations in situ RNAscope pour le VEGF humain, le TNF-α et l'IL-6 ont été réalisées en externe chez ACDBio/Biotechne à l'aide du test RNAscope 2.5 LSx Red. Des sondes personnalisées ont été conçues sur la base des transgènes humains à codons optimisés et marqués V5 exprimés par chaque AAV. Comme contrôles techniques, les sondes ACD Positive Control (Mm-Ppib, 313918, ACDBio) et ACD Negative Control (dapB, 312038, ACDBio) ont été utilisées. La récupération des épitopes a été effectuée pendant 15 min à 88 ° C et la protéolyse a été réalisée avec la protéase III pendant 15 min à 40 ° C à ACDBio. Les lames ont été imagées à l'aide d'un scanner de lames AxioScan.Z1 (objectif 20 ×, Carl Zeiss Microscopy GmbH).

Dans le cas de l'ensemble de données OIR, GRCm38.96 a été utilisé comme génome de référence. Pour l'étude AAV, un génome personnalisé a été créé en fusionnant des séquences optimisées en codons pour hIL6, hTNFa et hVEGF dans le génome de la souris. La génération d'indices génomiques et l'alignement des lectures ont été effectués via STAR (version 2.5.2b). La quantification au niveau des gènes a été effectuée à l'aide de FeatureCounts (version 1.5.1) et de RSEM (version 1.3.0), tout en éliminant les lectures multicartographie. Les mesures de contrôle de la qualité ont été obtenues à l'aide de MultiQC (version 1.0), avec des informations rassemblées à partir de STAR, picardmetrics (version 0.2.4) et fastQC (version 0.11.5), entre autres sources.

Les gènes dont le nombre de lectures était inférieur à 10 dans tous les échantillons de l'étude AAV ou OIR ont été supprimés de notre analyse. Nous avons normalisé les valeurs d'expression des comptes à l'aide de la fonction voom fournie par limma (version 3.44.3). Dans l'étude AAV, nous avons corrigé un effet de lot identifié associé au lot d'extraction d'ARN (variable : rna_extraction_batch) à l'aide de la fonction ComBat (package sva version 3.40.0). L'analyse en composantes principales a été effectuée à l'aide du package pcaMethods R (version 1.80.0) en sélectionnant les 1000 gènes les plus variables.

L'expression différentielle des gènes a été calculée à l'aide de la fonction lmFit fournie par le package limma R. Les gènes qui changent de manière significative ont été sélectionnés sur la base d'une valeur de p ajustée à BH < 0,05. Les informations sur les voies ont été récupérées à l'aide du package R misgdbr (version 7.1.1). L'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes a été effectuée à l'aide de la fonction d'analyse de surreprésentation (ORA) fournie par Clusterprofiler version 4.0.2. Des comparaisons directes entre les ensembles de gènes issus de l'expérience AAV et de l'étude OIR ont été réalisées à l'aide d'un test hypergéométrique fourni par le package stats R (version 4.1.0). Les diagrammes de Venn ont été tracés à l'aide de ggvenn (version 0.1.9).

Des ensembles de données d'ARN-Seq à cellule unique ont été obtenus à partir de GSE1352229, GSE130636 et GSE135922. Si nécessaire, les ID d'ensemble humain ont été mappés sur l'homologue de souris à l'aide du package biomaRt R (2.48.2), avec le paramètre d'hôte défini sur http://feb2021.archive.ensembl.org/. Les comptages bruts ont ensuite été traités à l'aide du package Seurat R (version 4.0.3). Des gènes spécifiques aux cellules ont été identifiés pour chaque ensemble de données individuel et type de cellule via la fonction FindMarkers. Les gènes ont été définis comme spécifiques à la cellule si la valeur de p ajustée à la BH <0, 01 et le gène n'a pas été identifié comme spécifique à un autre type de cellule (gènes uniques uniquement). Comme ci-dessus, le chevauchement entre les gènes marqueurs spécifiques aux cellules et les ensembles de gènes dérivés des études AAV ou OIR a été quantifié par la partie fonction ORA de clusterProfiler.

Toutes les données ont été déposées dans la base de données Gene Expression Omnibus (GEO) et sont disponibles sous GSE200191 et GSE200195. Le code utilisé pour cette étude est disponible sous https://github.com/bi-compbio/AAV_retinopathy_models.

Kliffen, M., Sharma, HS, Mooy, CM, Kerkvliet, S. & de Jong, PTVM Augmentation de l'expression des facteurs de croissance angiogéniques dans la maculopathie liée à l'âge. Br. J. Ophtalmol. 81, 154 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiello, LP et al. Facteur de croissance endothélial vasculaire dans le liquide oculaire des patients atteints de rétinopathie diabétique et d'autres troubles rétiniens. N. Engl. J. Med. 331, 1480-1487 (1994).

Article CAS PubMed Google Scholar

Funatsu, H. et al. Les niveaux vitreux d'interleukine-6 ​​et de facteur de croissance endothélial vasculaire sont liés à l'œdème maculaire diabétique. Ophtalmologie 110, 1690–1696 (2003).

Article PubMed Google Scholar

Stone, J. et al. Rôles du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire et de la dégénérescence des astrocytes dans la genèse de la rétinopathie du prématuré. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 37, 290-299 (1996).

CAS Google Scholar

Lim, LS, Mitchell, P, Seddon, JM, Holz, FG et Wong, TY Dégénérescence maculaire liée à l'âge. Lancet 379, 1728-1738 (2012).

Article PubMed Google Scholar

Nicholson, BP & Schachat, AP Un examen des essais cliniques d'agents anti-VEGF pour la rétinopathie diabétique. Graefe's Archive Clin. Exp. Ophtalmol. 248, 915–930 (2010).

Article CAS Google Scholar

Demircan, N., Safran, BG, Soylu, M., Ozcan, AA et Sizmaz, S. Détermination des taux d'interleukine-1 vitreuse (IL-1) et de facteur de nécrose tumorale (TNF) dans la rétinopathie diabétique proliférante. Oeil 20, 1366-1369 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Funatsu, H. et al. Les niveaux de cytokines dans l'humeur aqueuse sont liés aux niveaux vitreux et à la progression de la rétinopathie diabétique chez les patients diabétiques. Graefe's Archive Clin. Exp. Ophtalmol. 243, 3–8 (2005).

Article CAS Google Scholar

Lacombe, MS et al. Humeur aqueuse et facteur de nécrose tumorale sérique-α dans l'uvéite clinique. Res ophtalmique. 33, 251-255 (2001).

Article Google Scholar

de Boer, JH et al. Analyse des niveaux d'IL-6 dans le liquide vitré humain provenant de patients atteints d'uvéite, de patients atteints de troubles intraoculaires prolifératifs et d'yeux de banque d'yeux. Courant. Oeil Rés. 11, 181-186 (2009).

Article Google Scholar

Smith, LE et al. Rétinopathie induite par l'oxygène chez la souris. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 35, 101-111 (1994).

CAS Google Scholar

Scott, A. & Fruttiger, M. Rétinopathie induite par l'oxygène : un modèle de pathologie vasculaire dans la rétine. Oeil 24, 416–421 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lai, C.-M. et coll. Génération de souris transgéniques avec néovascularisation rétinienne légère et sévère. Br. J. Ophtalmol. 89, 911 (2005).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rahman, ISA, Li, C.-R., Lai, C.-M. & Rakoczy, EP Surveillance in vivo des lésions rétiniennes induites par le VEGF dans le modèle murin kimba de néovascularisation rétinienne. Courant. Oeil Rés. 36, 654–662 (2011).

Article Google Scholar

Ohno-Matsui, K. et al. L'expression inductible du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire chez la souris adulte provoque une rétinopathie proliférative sévère et un décollement de la rétine. Suis. J. Pathol. 160, 711–719 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiello, LP et al. La perméabilité rétinienne induite par le facteur de croissance endothélial vasculaire est médiée par la protéine kinase C in vivo et supprimée par un inhibiteur sélectif d'isoforme efficace par voie orale. Diabète 46, 1473–1480 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ozaki, H. et al. La libération prolongée intravitréenne de VEGF provoque une néovascularisation rétinienne chez le lapin et une rupture de la barrière hémato-rétinienne chez le lapin et le primate. Exp. Oeil Rés. 64, 505–517 (1997).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tolentino, MJ et al. Le facteur de croissance endothélial vasculaire est suffisant pour produire une néovascularisation de l'iris et un glaucome néovasculaire chez un primate non humain. Cambre. Ophtalmol. 114, 964–970 (1996).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weigelt, CM et al. L'expression médiée par l'AAV du VEGF humain, du TNF-α et de l'IL-6 induit une pathologie rétinienne chez la souris. Trad. Vis. Sci. Technol. 10, 15-15 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, F. et al. L'expression médiée par l'AAV du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire induit une néovascularisation choroïdienne chez le rat. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 44, 781–790 (2003).

Article Google Scholar

Lebherz, C. et al. Modèles de primates non humains pour la néovascularisation oculaire diabétique utilisant la surexpression médiée par AAV2 du facteur de croissance endothélial vasculaire. Diabète 54, 1141–1149 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rakoczy, PE et al. Amélioration de l'expression du facteur de croissance endothéliale vasculaire médiée par le virus adéno-associé recombinant dans la rétine de souris adulte : un modèle potentiel de rétinopathie diabétique. Diabète 52, 857–863 (2003).

Article CAS PubMed Google Scholar

Liu, S. et al. Un nouveau modèle de rat de néovascularisation choroïdienne quiescente naïve de traitement induite par la surexpression du VEGF165 humain. Biol. Ouvrez https://doi.org/10.1242/bio.048736 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sone, H. et al. Effets de l'administration intraoculaire ou systémique d'anticorps neutralisants contre le facteur de croissance endothélial vasculaire sur le modèle expérimental murin de rétinopathie. Vie Sci. 65, 2573-2580 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rosenbaum, JT, McDevitt, HO, Guss, RB & Egbert, PR Uvéite induite par l'endotoxine chez le rat comme modèle de maladie humaine. Nature 286, 611–613 (1980).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Agarwal, RK, Silver, PB & Caspi, RR Méthodes et protocoles d'auto-immunité. Méthodes Mol. Biol. 900, 443–469 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Caspi, RR et al. Un nouveau modèle de maladie auto-immune. Uvéorétinite auto-immune expérimentale induite chez la souris par deux antigènes rétiniens différents. J. Immunol. Baltim. MD 140, 1490–1495 (1988).

CAS Google Scholar

Jiang, W., Anderson, MS, Bronson, R., Mathis, D. et Benoist, C. Modifier l'auto-immunité provoquée par une déficience en Aire. J. Exp. Méd. 202, 805–815 (2005).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

DeVoss, J. et al. Auto-immunité spontanée empêchée par l'expression thymique d'un seul auto-antigène. J. Exp. Méd. 203, 2727-2735 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cunha, APD et al. La hiérarchie des cytokines pro-inflammatoires dans l'inflammation oculaire. Courant. Oeil Rés. 43, 1–13 (2017).

Google Scholar

Hoekzema, R., Murray, PI, van Haren, MA, Helle, M. & Kijlstra, A. Analyse de l'interleukine-6 ​​dans l'uvéite induite par l'endotoxine. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 32, 88–95 (1991).

CAS Google Scholar

Nakazawa, T. et al. Le facteur de nécrose tumorale-α médie la mort des oligodendrocytes et retarde la perte de cellules ganglionnaires rétiniennes dans un modèle murin de glaucome. J. Neurosci. 26, 12633-12641 (2006).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sartani, G. et al. La thérapie anti-facteur de nécrose tumorale alpha supprime l'induction de l'uvéorétinite auto-immune expérimentale chez la souris en inhibant l'amorçage antigénique. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 37, 2211-2218 (1996).

CAS Google Scholar

Hohki, S. et al. Le blocage de la signalisation de l'interleukine-6 ​​supprime l'uvéorétinite auto-immune expérimentale par l'inhibition des réponses inflammatoires Th17. Exp. Oeil Rés. 91, 162-170 (2010).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Dick, AD, Duncan, L., Hale, G., Waldmann, H. & Isaacs, J. L'activité neutralisante du TNF-alpha module le phénotype et la fonction des lymphocytes T dans l'uvéorétinite auto-immune expérimentale. J. Autoimmun. 11, 255-264 (1998).

Article CAS PubMed Google Scholar

Becker, K. et al. Une analyse transcriptomique approfondie de la rétine humaine révèle les mécanismes moléculaires sous-jacents à la rétinopathie diabétique. Sci. Rep. 11, 10494 (2021).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kim, EJ et al. Le profilage complet du transcriptome des tissus oculaires normaux et liés à la dégénérescence maculaire liée à l'âge révèle un dérèglement de la transcription antisens. Sci. Rep. 8, 3040 (2018).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ratnapriya, R. et al. Les analyses du transcriptome rétinien et de l'eQTL identifient les gènes associés à la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Nat. Genet. 51, 606–610 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, Y. et al. Analyse du transcriptome rétinien à l'échelle du génome de l'uvéite induite par l'endotoxine chez la souris avec séquençage de nouvelle génération. Mol. Vis. 23, 395–406 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, L. et al. Les dommages causés par la lumière ont induit des changements dans l'expression des gènes rétiniens chez la souris. Exp. Oeil Rés. 79, 239–247 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Uren, PJ, Lee, JT, Doroudchi, MM, Smith, AD & Horsager, A. Un profil des changements transcriptomiques dans le modèle de souris rd10 de la rétinite pigmentaire. Mol. Vis. 20, 1612-1628 (2014).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Xing, X. et al. Identification de nouveaux gènes différentiellement exprimés dans les rétines de rats diabétiques à long terme induits par la STZ par séquençage d'ARN. Mol. Genet. Génome. Méd. 8, e1115 (2020).

CAS Google Scholar

Guarischi-Sousa, R. et al. Une signature basée sur le transcriptome de l'angiogenèse pathologique prédit la survie des patientes atteintes d'un cancer du sein. Plos Genet. 15, e1008482 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. MiARN différentiellement exprimés dans des modèles de souris nouveau-nés de rétinopathie induite par l'oxygène. Mol. Méd. Rep. 15, 146-152 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhou, H. et al. Profils de circRNA induits par l'oxygène et réseaux de corégulation dans un modèle de rétinopathie de souris prématurée. Exp. Là. Méd. 18, 2037-2050 (2019).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, X., Dong, X., Jia, C. & Wang, Y. Profilage des gènes associés au modèle murin de rétinopathie induite par l'oxygène. Mol. Vis. 19, 775–788 (2013).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desjarlais, M. et al. Profil d'expression de microARN dans la rétine et la choroïde dans le modèle de rétinopathie induite par l'oxygène. PLoS ONE 14, e0218282 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heng, JS et al. Analyse complète d'un modèle murin d'uvéorétinite spontanée utilisant le séquençage d'ARN unicellulaire. Proc. Nat. Acad. Sci. 116, 26734–26744 (2019).

Article ADS CAS PubMed Central Google Scholar

Voigt, AP et al. Transcriptomique unicellulaire de l'épithélium pigmentaire rétinien humain et de la choroïde dans la santé et la dégénérescence maculaire. Proc. Nat. Acad. Sci. 116, 24100–24107 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun, L. et al. Séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-Seq) déchiffrant les altérations pathologiques dans les rétines diabétiques induites par la streptozotocine. Exp. Oeil Rés. 210, 108718 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hove, IV et al. L'analyse du transcriptome unicellulaire de la rétine de la souris Akimba révèle des informations spécifiques au type de cellule sur la pathobiologie de la rétinopathie diabétique. Diabetologia 63, 2235-2248 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Lu, Y. et al. L'analyse unicellulaire de la rétine humaine identifie les mécanismes évolutifs conservés et spécifiques à l'espèce contrôlant le développement. Dév. Cellule 53, 473-491.e9 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lukowski, SW et al. Un atlas de transcriptome unicellulaire de la rétine humaine adulte. EMBO J. 38, e100811 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Voigt, AP et al. Caractérisation moléculaire de la rétine fovéale par rapport à la rétine humaine périphérique par séquençage d'ARN unicellulaire. Exp. Oeil Rés. 184, 234–242 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klimczak, RR, Koerber, JT, Dalkara, D., Flannery, JG & Schaffer, DV Une nouvelle variante virale adéno-associée pour une transduction intravitréenne efficace et sélective de cellules de rat müller. PLoS ONE 4, e7467 (2009).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bradley, J. Maladie inflammatoire médiée par le TNF. J. Pathol. 214, 149–160 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weigelt, CM et al. Caractérisation et validation de modèles in vitro et in vivo pour étudier l'inflammation induite par le TNF-α dans les maladies rétiniennes. Trad. Vis. Sci. Technol. 11, 18 (2022).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sennlaub, F., Courtois, Y. & Goureau, O. L'oxyde nitrique synthase inductible médie l'apoptose rétinienne dans la rétinopathie proliférative ischémique. J. Neurosci. 22, 3987–3993 (2002).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dejda, A. et al. La neuropiline-1 assure la médiation de la chimioattraction des cellules myéloïdes et influence la diaphonie neuro-immune rétinienne. J.Clin. Enquête 124, 4807–4822 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. et al. Thérapie génique du glaucome par perturbation de l'aquaporine 1 du corps ciliaire à l'aide de CRISPR-Cas9. Mol. Là. 28, 820–829 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yates, JRW et al. Variante C3 du complément et risque de dégénérescence maculaire liée à l'âge. N. Engl. J. Med. 357, 553–561 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fritsche, LG et al. Une vaste étude d'association à l'échelle du génome de la dégénérescence maculaire liée à l'âge met en évidence les contributions de variantes rares et courantes. Nat. Genet. 48, 134–143 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Haines, JL et al. La variante du facteur H du complément augmente le risque de dégénérescence maculaire liée à l'âge. Sciences 308, 419-421 (2005).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Yang, M. et al. Association des polymorphismes C2 et CFB avec l'uvéite antérieure. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 53, 4969 (2012).

Article CAS Google Scholar

Natoli, R. et al. Les macrophages rétiniens synthétisent C3 et activent le complément dans la DMLA et dans les modèles de dégénérescence rétinienne focale exprimant le complément de macrophages rétiniens dans la DMLA. Investir. Ophte. Vis. Sci. 58, 2977-2990 (2017).

Article CAS Google Scholar

Anderson, DH et al. Le rôle central du système du complément dans le vieillissement et la dégénérescence maculaire liée à l'âge : hypothèse revisitée. Programme. Rétin. Oeil Rés. 29, 95-112 (2010).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mondino, BJ, Glovsky, MM & Ghekiere, L. Complément activé dans l'humeur aqueuse enflammée. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 25, 871–873 (1984).

CAS Google Scholar

Bansal, R. et al. Profil protéomique du vitré chez les patients atteints d'uvéite tuberculeuse. Tuberculose 126, 102036 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vergani, S. et al. Activation du complément dans l'uvéite. Copain. J. Ophtalmol. 70, 60 (1986).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Akhtar-Schäfer, I., Wang, L., Krohne, TU, Xu, H. & Langmann, T. Modulation de trois voies immunitaires innées clés pour les maladies dégénératives rétiniennes les plus courantes. EMBO Mol. Méd. https://doi.org/10.15252/emmm.201708259 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Liao, DS et al. Compléter le pegcetacoplan inhibiteur de C3 pour l'atrophie géographique secondaire à la dégénérescence maculaire liée à l'âge. Ophtalmologie 127, 186–195 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Jaffé, GJ et al. Avacincaptad Pegol, inhibiteur du C5, pour l'atrophie géographique due à la dégénérescence maculaire liée à l'âge : un essai pivot randomisé de phase 2/3. Ophtalmologie https://doi.org/10.1016/j.ophtha.2020.08.027 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Cashman, SM, Desai, A., Ramo, K. et Kumar-Singh, R. L'expression du composant complémentaire 3 (C3) d'un adénovirus conduit à une pathologie dans la rétine murine. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 52, 3436–3445 (2011).

Article CAS Google Scholar

Landowski, M. et al. Le polymorphisme du facteur H Y402H du complément humain provoque un phénotype de dégénérescence maculaire liée à l'âge et une dérégulation des lipoprotéines chez la souris. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 116, 3703–3711 (2019).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Song, D. et al. La mutation W1206R du facteur H du complément provoque une thrombose rétinienne et une rétinopathie ischémique chez la souris. Suis. J. Pathol. 189, 826–838 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ufret-Vincenty, RL et al. Les souris transgéniques exprimant des variantes du facteur H du complément développent des résultats rétiniens de type AMD. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 51, 5878–5887 (2010).

Article Google Scholar

Williams, JAE et al. Régulation de l'activation de C3 par la voie alternative du complément dans la rétine de souris. PLoS ONE 11, e0161898 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, L., Bell, BA, Li, Y., Caspi, RR & Lin, F. Le composant C4 du complément régule le développement de l'uvéite auto-immune expérimentale par un mécanisme intrinsèque aux cellules T. Devant. Immunol. 8, 1116 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kumar, B., Cashman, SM & Kumar-Singh, R. Activation médiée par le complément de l'inflammasome NLRP3 et son inhibition par l'administration de CD59 médiée par l'AAV dans un modèle d'uvéite. Mol. Là. 26, 1568-1580 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bora, N.-É. et al. L'activation du complément via une voie alternative est essentielle dans le développement de la néovascularisation choroïdienne induite par laser : Rôle du facteur B et du facteur HJ Immunol. 177, 1872–1878 (2006).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kim, SJ et al. Facteur H du complément humain intravitréen dans un modèle de rat de néovascularisation choroïdienne induite par laser. Br. J. Ophtalmol. 97, 367 (2013).

Article PubMed Google Scholar

Brockmann, C. et al. L'inhibition intravitréenne du complément C5a réduit la néovascularisation choroïdienne chez la souris. Graefe's Archive Clin. Exp. Ophtalmol. 253, 1695-1704 (2015).

Article CAS Google Scholar

Peng, K. et al. MAdCAM-1 médie la dégénérescence des neurones rétiniens dans la colite expérimentale en recrutant des lymphocytes T CD4 + intestinaux. Immunol Muqueux. 14, 152–163 (2021).

Article PubMed Google Scholar

Grant, AJ, Lalor, PF, Hübscher, SG, Briskin, M. & Adams, DH MAdCAM-1 exprimé dans une maladie inflammatoire chronique du foie soutient l'adhésion des lymphocytes muqueux à l'endothélium hépatique (MAdCAM-1 dans une maladie inflammatoire chronique du foie). Hépatologie 33, 1065-1072 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Oshima, T. et al. Régulation et distribution de MAdCAM-1 dans les cellules endothéliales in vitro. Suis. J. Physiol.-Cell Physiol. 281, C1096–C1105 (2001).

Article CAS PubMed Google Scholar

Catalan-Serra, I. & Brenna, Ø. Immunothérapie dans les maladies inflammatoires de l'intestin : traitements nouveaux et émergents. Hum. Aspir. Immunautre. https://doi.org/10.1080/21645515.2018.1461297 (2018).

Article Google Scholar

Hysa, E. et al. Immunopathophysiologie et impact clinique de l'uvéite dans les maladies rhumatismales inflammatoires : une mise à jour. EUR. J.Clin. Enquête 51, e13572 (2021).

Article CAS Google Scholar

Sugita, S. et al. Inhibition de l'inflammation médiée par les lymphocytes T dans l'uvéite par un nouvel anticorps anti-CD3. Arthrite Rés. Là. 19, 176 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zasada, M. et al. Impact à court et à long terme de l'hyperoxie sur le transcriptome des cellules sanguines et rétiniennes dans un modèle murin de rétinopathie induite par l'oxygène. Pédiatre Rés. 87, 485–493 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Rocha, SF et al. Esm1 module le comportement des cellules de pointe endothéliales et la perméabilité vasculaire en améliorant la biodisponibilité du VEGF. Circ. Rés. 115, 581-590 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Su, T. et al. Le blocage d'Endocan supprime la néovascularisation oculaire expérimentale chez la souris. Enquête Opthalmol. Vis. Sci. 59, 930 (2018).

Article CAS Google Scholar

Vähätupa, M., Järvinen, TAH & Uusitalo-Järvinen, H. Exploration du modèle de rétinopathie induite par l'oxygène pour découvrir de nouvelles cibles médicamenteuses thérapeutiques dans les rétinopathies. Devant. Pharmacol. 11, 873 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Stahl, A. et al. La rétine de souris comme modèle d'angiogenèse. Enquête Ophtalmol. Vis. Sci. 51, 2813–2826 (2010).

Article Google Scholar

Diao, L., Sun, W., Deng, Q. & He, S. Développement de la rétine de souris : diversité morphologique émergente des cellules ganglionnaires. J. Neurobiol. 61, 236-249 (2004).

Article PubMed Google Scholar

Selvam, S., Kumar, T. & Fruttiger, M. Développement de la vascularisation rétinienne dans la santé et la maladie. Programme. Rétin. Oeil Rés. 63, 1–19 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vessey, KA, Wilkinson-Berka, JL & Fletcher, EL Caractérisation de la fonction rétinienne et de la réponse des cellules gliales dans un modèle murin de rétinopathie induite par l'oxygène. J. Comp. Neurol. 519, 506-527 (2011).

Article CAS PubMed Google Scholar

Fletcher, EL et al. L'importance des modifications des cellules neuronales et gliales dans la rétine du rat au cours de la rétinopathie induite par l'oxygène. Doc. Ophtalmol. 120, 67–86 (2010).

Article PubMed Google Scholar

Télécharger les références

Nous sommes très reconnaissants à Manuel Deubler, Jürgen Haller, Jan Hering, Oliver Da Cruz Rodrigues Radmacher pour leur excellente assistance technique concernant toutes les expériences AAV in vivo et Heike Bühler, Sabine Baierl et Martin Steiner pour l'expérience OIR. La génération d'AAV a été soutenue par Benjamin Strobel et le laboratoire AAV de Boehringer Ingelheim. Nous remercions Daniel Gerlach pour son aide dans la création des fichiers de génome personnalisés pour l'étude AAV et Tanja Schönberger pour son soutien à l'analyse histologique. Nous remercions Elke Markert et Thomas Ciossek pour des discussions scientifiques fructueuses. La figure 1a a été générée avec BioRender.com.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Kolja Becker et Carina M. Weigelt.

Ces auteurs ont supervisé conjointement ce travail : Holger Klein et Norbert H. Redemann.

Biologie computationnelle mondiale et sciences numériques, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Allemagne

Kolja Becker, Coralie Viollet, Werner Rust, Francesc Fernandez-Albert, Eric Simon & Holger Klein

Recherche sur les maladies cardiométaboliques, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Allemagne

Carina M. Weigelt, Holger Fuchs, Nina Zippel, Remko A. Bakker et Norbert H. Redemann

Sciences de la découverte de médicaments, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riss, Allemagne

Hannah Wyatt et Thorsten Lamla

Développement clinique et opérations Corporate, Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG, Biberach an der Riß, Allemagne

Jochen Huber

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

KB et CMW ont conçu les expériences, interprété les résultats, rédigé le manuscrit et préparé les figures. KB a effectué l'analyse bioinformatique et CMW a réalisé les expériences in vivo et in vitro. CV et WR ont conçu et réalisé le séquençage de l'ARN et HW a pris en charge l'analyse histologique et TL la production d'AAV. HF et JH ont supervisé les expériences in vivo et NZ ont soutenu les expériences in vitro. FF, RAB, HK et NHR ont supervisé le projet et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu le manuscrit et contribué à la révision.

Correspondance à Kolja Becker.

Tous les auteurs sont des employés de Boehringer Ingelheim et l'étude a été entièrement financée par Boehringer Ingelheim.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Becker, K., Weigelt, CM, Fuchs, H. et al. Analyse du transcriptome de modèles de rétinopathie induite par l'AAV exprimant le VEGF humain, le TNF-α et l'IL-6 dans les yeux murins. Sci Rep 12, 19395 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

Télécharger la citation

Reçu : 20 avril 2022

Accepté : 25 octobre 2022

Publié: 12 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-23065-4

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.