Les invadopodes permettent l'invasion coopérative et la métastase des cellules cancéreuses du sein

Communications Biology volume 5, Article number: 758 (2022) Citer cet article

2535 accès

3 Citations

19 Altmétrique

Détails des métriques

Les cellules cancéreuses invasives et non invasives peuvent envahir ensemble lors de l'invasion coopérative. Cependant, les événements qui y conduisent, le rôle de la transition épithélio-mésenchymateuse et les conséquences que celle-ci peut avoir sur les métastases sont inconnus. Dans cette étude, nous démontrons que les cellules cancéreuses du sein isogéniques 4T1 et 67NR se trient les unes des autres dans des sphéroïdes 3D, suivies d'une invasion coopérative. Par microscopie accélérée, nous montrons que les cellules invasives 4T1 se déplacent de manière plus persistante par rapport aux cellules 67NR non invasives, triant et s'accumulant à l'interface sphéroïde-matrice, un processus dépendant des adhérences cellule-matrice et indépendant de la cellule-cellule E-cadhérine. adhérences. L'élimination des invadopodes dans les cellules 4T1 bloque l'invasion, démontrant que les besoins en invadopodes sont limités aux cellules leaders. Surtout, nous démontrons que les cellules avec et sans invadopodes peuvent également s'engager dans des métastases coopératives dans des modèles murins précliniques. Dans l'ensemble, nos résultats suggèrent qu'un petit nombre de cellules avec des invadopodes peuvent entraîner la métastase d'amas de cellules hétérogènes.

Plus de 90 % des patients atteints de cancer meurent des suites de complications résultant de métastases, c'est-à-dire du processus de dissémination, de réensemencement et de croissance des cellules cancéreuses dans les organes secondaires1,2. Dans le cancer du sein, des travaux récents ont démontré que les métastases proviennent majoritairement d'ensemencements polyclonaux3,4. Ces métastases polyclonales se développent à partir de la dissémination collective d'amas cellulaires, par opposition à l'accumulation successive de multiples clones uniques. Avec la littérature croissante sur l'hétérogénéité phénotypique dans les tumeurs primaires5, ces observations suggèrent que la coopérativité entre les clones de cellules cancéreuses peut faciliter la métastase.

Dans le cancer du sein, la cascade métastatique est initiée lorsque les cellules cancéreuses acquièrent des propriétés invasives, qui incluent l'intégration de la motilité et la capacité de dégrader la matrice extracellulaire (ECM)2. L'invasion et la motilité sont couramment associées à l'activation du programme de transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT)6. Au cours de l'EMT, les cellules épithéliales perdent progressivement les contacts cellule-cellule, renforcent progressivement leurs adhérences à l'ECM et augmentent leur contractilité, devenant mobiles. Parallèlement à l'EMT, les cellules cancéreuses peuvent également acquérir la capacité de dégrader localement l'ECM en utilisant des invadopodes7,8,9,10. Les invadopodes sont des saillies membranaires enrichies en métalloprotéinases matricielles (MMP) qui confèrent aux cellules cancéreuses une activité protéolytique élevée11,12 et, surtout, un potentiel métastatique élevé13,14. Étant donné que le programme EMT n'est pas un commutateur binaire ni unidirectionnel, et que plusieurs voies EMT existent, des trajectoires EMT distinctes peuvent entraîner des clones de cancer avec différents niveaux d'invasivité15.

Des travaux récents in vitro en 3D sur le cancer du sein ont montré que les brins collectifs invasifs sont composés de cellules cancéreuses qui diffèrent par de multiples traits invasifs3,16,17,18,19,20. Par exemple, par rapport aux cellules suiveuses, les cellules leaders présentent une contractilité accrue19, une adhésion cellule-ECM3,16, un remodelage de l'ECM20 et des capacités de dégradation de l'ECM18,19. En conséquence, les cellules leaders peuvent permettre l'invasion de cellules suiveuses autrement non invasives, un phénomène appelé invasion coopérative21. Nos travaux récents ont montré que les cellules leader résident en grande partie dans la phase G1 du cycle cellulaire, la phase du cycle cellulaire au cours de laquelle la dégradation de l'ECM médiée par les invadopodes est la plus élevée22. Ces données suggèrent que lors de l'invasion collective, les cellules leaders peuvent assembler préférentiellement des invadopodes. Bien que la rupture de l'ECM soit clairement nécessaire pour l'invasion collective, le rôle de la dégradation de l'ECM médiée par les invadopodes dans les cellules leader par rapport aux cellules suiveuses n'est pas clair. A ce jour, aucune étude n'a détaillé la réorganisation spatiale qui peut précéder l'envahissement coopératif. De plus, comme toutes les études précédentes ont enquêté sur l'invasion coopérative dans les cultures 3D, la coopération lors de la dissémination et de la métastase n'a pas encore été explorée.

Dans cette étude, nous visons à comprendre comment les clones de cancer avec des compétences invasives différentielles peuvent coopérer lors de l'invasion et de la métastase. Nous montrons que les clones invasifs peuvent trier et conduire des clones non invasifs vers une invasion coopérative et des métastases. Notre étude suggère que la coopérativité entre les cellules cancéreuses peut être un mécanisme efficace pour les métastases collectives.

Pour étudier comment les clones de cancer avec des compétences invasives différentielles coopèrent pendant la métastase, nous avons utilisé la paire isogénique de lignées cellulaires de cancer du sein 4T1 et 67NR, syngéniques aux souris Balb/C23,24. Lors de l'implantation orthotopique, les deux lignées cellulaires développent des tumeurs primaires, mais seules les cellules 4T1 métastasent25. Nous avons évalué les capacités invasives des cellules 4T1 et 67NR dans le test d'invasion sphéroïde dans le collagène I à haute densité, qui nécessite une dégradation de la matrice induite par les MMP22. Après deux jours, nous avons constaté que les cellules 4T1 présentaient une invasion robuste dans la matrice de collagène I, tandis que les cellules 67NR n'envahissaient pas (Fig. 1a, b). Le traitement avec l'inhibiteur pan-MMP GM6001 a efficacement bloqué l'invasion des cellules 4T1 (Fig. 1a, b). De plus, le marquage par immunofluorescence des sites de clivage du collagène I médié par la MMP (Col ¾) a montré que l'invasion des cellules 4T1 dans la matrice était dépendante de la MMP (Fig. 1c). Le traitement par la mitomycine C, qui altère la division cellulaire26, a confirmé que l'invasion des cellules 4T1 n'était pas due à la prolifération cellulaire (Figs. 1a, b et S1). Les cellules 4T1 sont connues pour envahir en tant que brins collectifs, avec la présence de E-cadhérine aux jonctions cellule-cellule27,28. Nous avons confirmé que les cellules 4T1 exprimaient la E-cadhérine, tandis que les cellules 67NR exprimaient la N-cadhérine (Fig. S2a, b)27,28,29. Les lignées cellulaires 4T1 et 67NR exprimaient la vimentine (Fig. S2a). Fait intéressant, sur l'axe EMT (continuum phénotypique de l'épithélium au mésenchyme), cela classe les cellules invasives 4T1 comme épithéliales/mésenchymateuses et les cellules 67NR non invasives comme mésenchymateuses. En outre, dans les sphéroïdes 4T1, nous avons constaté que la E-cadhérine était enrichie à toutes les jonctions cellule-cellule, à savoir entre les cellules leader et suiveuses ainsi qu'entre les cellules suiveuses et suiveuses. Cela a vérifié que l'intégrité des jonctions cellule-cellule médiées par la E-cadhérine était maintenue pendant l'invasion (Fig. S2c, d)30. Dans l'ensemble, ces résultats ont démontré que les cellules 4T1 effectuent une invasion collective dépendante des MMP, tandis que les cellules 67NR n'envahissent pas la matrice dense de collagène I.

a Sphéroïdes de cellules 4T1 et 67NR au jour 0 et au jour 2 après l'intégration dans une matrice de collagène I 3D. Les noyaux ont été colorés au DAPI. Les sphéroïdes ont été traités à partir du jour 0 avec un inhibiteur pan-MMP (GM6001, panneau en haut à droite), un inhibiteur du cycle cellulaire (mitomycine C, Mito C, panneau en bas à droite) ou un contrôle DMSO (panneaux de gauche). Barres d'échelle : 100 µm. b Surface sphéroïde en fonction du temps pour les cellules 4T1 et 67NR de (a). P = 5,81 × 10−4 et 1,23 × 10−4, par le test t. c Brin envahissant d'un sphéroïde 4T1, jour 2 après l'enrobage, immunomarqué pour le collagène I clivé par MMP (Col-3/4, vert) et coloré pour l'actine F (phalloïdine, magenta) et les noyaux (DAPI, bleu). Barre d'échelle : 50 µm. d Western blot de Tks5 et expression de la cortactine dans les cellules 4T1 et 67NR. La β-actine est utilisée comme contrôle de charge. e Dégradation de la gélatine pour les cellules 4T1 (panneau supérieur) et 67NR (panneau inférieur) 18 h après le placage. Les encarts montrent un zoom avant 4X de la zone encadrée et les pointes de flèches indiquent des trous de dégradation représentatifs. Barres d'échelle : 20 µm. Voir Fig. S3a pour la F-actine. f Zone de dégradation pour les cellules 4T1 et 67NR de (e). P < 4,40 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. g Cellules 4T1 cultivées sur gélatine fluorescente (gris), marquées pour Tks5 (vert) et F-actine (phalloïdine, magenta). Les encarts montrent un zoom avant 2X de la zone encadrée et les pointes de flèches indiquent des invadopodes fonctionnels représentatifs. Barre d'échelle : 10 µm. h Brin 4T1 le jour 2 jours après l'enrobage, étiqueté pour Tks5 (vert), collagène clivé (cyan), F-actine (magenta) et noyaux (bleu). Les encarts montrent un zoom avant de 1,25X de la zone encadrée. Barre d'échelle : 30 µm. i Monocouches 4T1 (à gauche) et 67NR (à droite) 24 h après la blessure. Les trajectoires cellulaires représentatives sont présentées. Voir Film S1. Barres d'échelle : 100 µm. j Trajectoires des cellules 4T1 (en haut) et 67NR (en bas) du test de plaie en (i), illustrées par des tracés en rose des vents déplacés vers une origine commune. k Vitesse instantanée des cellules 4T1 et 67NR de (j). P = 1,17 × 10−13, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. l Persistance (déplacement net/longueur du trajet) des cellules 4T1 et 67NR de (j). P < 2,20 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Des transferts Western non recadrés sont disponibles dans la Fig. S13 supplémentaire.

Les invadopodes sont des saillies membranaires enrichies en actine, en protéines liant l'actine, telles que la cortactine et Tks5, et en MMP11,12. Comme la fonction des invadopodes entraîne une dégradation locale de l'ECM, nous avons émis l'hypothèse que les invadopodes jouent un rôle dans l'invasion des cellules 4T1. Nous avons également estimé que la différence observée dans les capacités d'invasion des cellules 4T1 par rapport aux cellules 67NR pourrait s'expliquer, au moins en partie, par une disparité dans leur fonction d'invadopodes. Pour tester cela, nous avons d'abord analysé le niveau d'expression des composants clés des invadopodes cortactine et Tks511. Les deux lignées cellulaires exprimaient des niveaux similaires de cortactine et de Tks5 (Fig. 1d). Nous avons ensuite mesuré la fonction des invadopodes en cultivant des cellules sur de la gélatine marquée par fluorescence, ce qui permet de visualiser la dégradation sous forme de trous dans la matrice31. Nous avons constaté que les cellules 4T1, mais pas les cellules 67NR, étaient capables de dégrader la couche de gélatine (Fig. 1e, f). Des points ponctuels de Tks5, d'actine F et de gélatine dégradée co-localisés, indicatifs d'invadopodes fonctionnels et matures, étaient présents dans les cellules 4T1 (Fig. 1g). Ceci suggère que les trous de dégradation observés ont été générés par des invadopodes. Des points ponctuels de Tks5 et d'actine F co-localisés, indicatifs de précurseurs d'invadopodes, étaient présents dans les cellules 4T1 et 67NR, à des niveaux similaires (Fig. S3a, b). Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que les précurseurs d'invadopodes ne parviennent pas à mûrir dans les cellules 67NR. Pour examiner si les invadopodes jouent également un rôle dans l'invasion des cellules 4T1 dans les sphéroïdes, nous avons marqué les sphéroïdes pour les sites de clivage du collagène I médiés par la F-actine, Tks5 et MMP. Nous avons identifié des invadopodes fonctionnels dans les cellules leader, démontrés par la co-localisation des sites de clivage du collagène I médiés par la F-actine, Tks5 et MMP (Fig. 1h). Ces observations ont établi un lien entre les invadopodes et l'invasion collective des cellules 4T1 et suggèrent que les cellules leaders assemblent les invadopodes.

Étant donné que le phénotype d'invasion consiste en une dégradation de l'ECM et une migration cellulaire médiées par les invadopodes, nous avons effectué un test de grattage pour déterminer si les cellules 67NR peuvent migrer aussi efficacement que les cellules 4T1. Nous avons suivi des cellules individuelles (Fig. 1i, j et Movie S1) et avons constaté que si la vitesse instantanée des cellules 67NR est supérieure à celle des cellules 4T1 (Fig. 1k), les cellules 4T1 sont significativement plus persistantes que les cellules 67NR (Fig. 1l ).

En résumé, nous avons montré que la paire 4T1/67NR est un outil approprié pour étudier comment les clones de cancer avec des capacités invasives différentielles coopèrent lors de l'invasion.

Nous avons ensuite entrepris d'étudier la dynamique de l'organisation spatiale et de l'invasion dans les sphéroïdes où 4T1 et 67NR sont mélangés. Nous avons généré des lignées cellulaires 4T1-mScarlet et 67NR-GFP et les avons mélangées dans un rapport de 1:50, pour tenir compte du taux de prolifération plus élevé de 4T1 au cours du test d'invasion sphéroïde (Fig. S4a, b). Nous avons ensuite intégré les sphéroïdes mixtes dans le collagène I et effectué une imagerie longitudinale quotidienne (Figs. 2a et S4c)33. Nous avons remarqué que les cellules 67NR et 4T1 se triaient les unes des autres à partir du jour 3. Les tranches optiques individuelles (Film S2) et l'analyse des coordonnées cellulaires ont clairement démontré l'enrichissement des cellules 4T1 au bord des sphéroïdes (Figs. 2b et S4d). Pour quantifier le tri des cellules, nous avons calculé la distance relative de chaque cellule au centre du sphéroïde, une métrique que nous avons nommée Distance Index (DI), de sorte qu'une valeur de 0 marque une cellule au centre du sphéroïde et une valeur de 1 correspond à une cellule à l'interface sphéroïde-collagène I (Fig. 2c). Au jour 3 après l'enrobage, nous avons constaté que le DI des cellules 4T1 augmentait avec le temps et était significativement plus élevé que le DI des cellules 67NR (Fig. 2d). Cette tendance était également présente dans les sphéroïdes individuels (Fig. S4e). Ces données ont révélé qu'au cours de 3 jours, les cellules se sont réorganisées à partir d'une distribution aléatoire en sphéroïdes avec des cellules 4T1 peuplant l'interface et des cellules 67NR situées dans le noyau du sphéroïde. Aux jours 4 à 6, le tri cellulaire des cellules 4T1 et 67NR a été suivi de l'invasion (Fig. S4f).

a Sphéroïde mixte, à un rapport de 1:50 de cellules 4T1-mScarlet (magenta) à 67NR-GFP (vert), incorporées dans du collagène I 3D et imagées quotidiennement. Le jour 1 indique le jour 1 après l'intégration. Voir Film S2. Barre d'échelle : 100 µm. b Coordonnées des cellules 4T1-mScarlet (4T1-mScar, magenta) et 67NR-GFP (vert) de tous les sphéroïdes présentés en (a) et Fig. S3c. c Représentation schématique de l'indice de distance (DI) ; a et b représentent les axes semi-majeur/mineur du sphéroïde et d représente la distance entre le centre du sphéroïde et une cellule. DI est d/a, la distance relative de chaque cellule au centre du sphéroïde, voir Matériels et méthodes. d DI pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (boîtes vertes) des sphéroïdes dans (a, b). P = 1,32 × 10−14 et <2,20 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. e Sphéroïdes mixtes aux jours 3 et 4 après l'enrobage. Les sphéroïdes ont été traités à partir du jour 0 avec un inhibiteur de la contractilité cellulaire (inhibiteur ROCK, Y-27632, panneaux supérieurs) ou un inhibiteur pan-MMP (GM6001, panneaux inférieurs). Barre d'échelle : 100 µm. f DI pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (vert) des sphéroïdes en (e). g Schéma des compartiments de bord (gris foncé) et de noyau (gris clair) dans un sphéroïde. h Instantanés d'un sphéroïde mixte pris au début (jour 0,5, 10 h après l'intégration) et à la fin de l'enregistrement en accéléré (jour 2,5, 54 h après l'intégration). Pour les cellules 4T1-mScarlet et 67NR-GFP, les trajectoires cellulaires représentatives dans les compartiments de bord et de noyau, codées par couleur en fonction du temps, sont affichées (panneaux de droite). Barres d'échelle : 100 µm. i Δ Distance Index (ΔDI) pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (vert) des sphéroïdes en (h). Voir aussi Films S3–6. Un ΔDI positif indique la motilité cellulaire vers le bord du sphéroïde ("Out"), et un ΔDI négatif indique un mouvement vers le centre du sphéroïde ("In"). Les sphéroïdes ont été traités à partir du jour 0 avec le contrôle DMSO (à gauche) ou GM6001 (à droite). P = 0,0204, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. j Déplacements carrés moyens (MSD) pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (vert) des sphéroïdes en (h). Les MSD ont été calculés dans les directions radiale (gauche) et angulaire (droite) du système de coordonnées polaires pour les cellules de bord (lignes pleines) et centrales (lignes pointillées) dans les sphéroïdes traités avec du DMSO (en haut) et du GM6001 (en bas), respectivement. Les tracés sont présentés à l'échelle log-log, mettant en évidence la nature super-diffusive (α > 1), diffusive (α = 1) et sous-diffusive (α < 1) de la motilité. Les lignes pleines servent de guides à l'œil, indiquant les pentes moyennes (valeurs α) correspondant à ces différentes modalités de motilité. k L'exposant de la loi de puissance αr est illustré (à gauche) pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (vert) des compartiments de bord et de noyau dans un sphéroïde. Le coefficient de diffusion efficace dans la direction radiale est indiqué pour le contrôle DMSO (en haut à droite) ou GM6001 (en bas à droite) à partir des compartiments de bord et de noyau dans un sphéroïde.

Il a été démontré que les sphéroïdes des cellules 4T1 contiennent de la laminine, du collagène I et de la fibronectine dans l'espace extracellulaire34. La présence d'ECM dans un sphéroïde suggère que la motilité cellulaire 3D, et par conséquent le tri cellulaire, peut nécessiter des MMP. Pour tester le lien entre la motilité, les MMP et le tri cellulaire, nous avons traité des sphéroïdes avec un inhibiteur de la contractilité cellulaire (inhibiteur ROCK, Y-27632) ou un inhibiteur pan-MMP, GM6001. Nous avons constaté que les deux traitements bloquaient le tri cellulaire (Fig. 2e, f). Nous avons ensuite effectué une imagerie time-lapse de sphéroïdes mixtes. Nous avons suivi des cellules individuelles dans le sphéroïde (Fig. 2h et Films S3, 4) et pour chaque cellule, calculé la différence entre les indices de distance initial et final (ΔDI = DI pour la dernière position d'une cellule donnée - DI pour la position initiale d'une cellule donnée), de sorte qu'un ΔDI positif indique la motilité cellulaire vers le bord du sphéroïde ("out" sur la Fig. 2g, i), et un ΔDI négatif indique un mouvement vers le centre du sphéroïde ("in" sur la Fig. 2g, i ). Un ΔDI nul indique aucun mouvement net. Nous avons de nouveau classé chaque cellule en fonction de sa position initiale en tant que bord ou noyau, et défini le compartiment de bord comme une couche à deux cellules la plus proche de l'interface sphéroïde-collagène (anneau elliptique de 30 µm de large; Fig. 2g). Nous avons constaté que le pourcentage de cellules suivies qui ont basculé entre les compartiments pendant la durée de l'imagerie en accéléré était négligeable pour toutes les cellules, à l'exception des cellules 4T1 initialement situées dans le noyau (Fig. S5a). Pour les cellules 4T1, nous avons constaté que le ΔDI était significativement plus élevé pour les cellules dont la position initiale était dans le noyau sphéroïde par rapport aux cellules dont la position initiale était au bord du sphéroïde (Fig. 2h, i). Cela indique que les cellules 4T1 se sont déplacées du noyau sphéroïde vers le bord sphéroïde. En revanche, les cellules 4T1 situées au bord du sphéroïde avaient un ΔDI proche de zéro, ce qui suggère que les cellules 4T1 qui se trouvaient initialement au bord du sphéroïde se déplaçaient uniquement dans ce compartiment (Fig. 2i). Les ΔDI étaient minimes pour toutes les cellules 67NR, quelle que soit leur position initiale, indiquant que ces cellules ne se déplaçaient que dans les compartiments dans lesquels elles se trouvaient initialement (Fig. 2i). Le ΔDI comparant les positions initiale et finale des cellules, cette métrique ne renseigne pas sur la persistance des cellules. En effet, pour un ΔDI donné, la trajectoire de la cellule peut être plus ou moins tortueuse. En calculant le déplacement carré moyen (MSD) des cellules dans le système de coordonnées polaires, qui capture la symétrie sphéroïde, nous avons déterminé que les cellules 4T1 sont plus persistantes dans la direction radiale (super-diffusives, α > 1) que les cellules 67NR (diffusives, α = 1) (Fig. 2j, k et S5b–d). Les cellules 4T1 et 67NR avaient un comportement de motilité similaire dans la direction angulaire (Figs. 2j et S5b, c). Le traitement des sphéroïdes avec GM6001 a altéré le mouvement des cellules 4T1 du noyau vers le bord (Fig. 2i – k, Films S5, 6) et a entraîné une réduction du coefficient de diffusion effectif de toutes les cellules dans la direction radiale (Fig. 2j, k et S5b–d). Nous avons confirmé que la croissance des sphéroïdes était similaire dans les conditions GM6001 et DMSO, suggérant que la perte de tri cellulaire était indépendante de la prolifération cellulaire (Fig. S5e). Pris ensemble, ces résultats indiquent que le tri cellulaire dans les sphéroïdes mixtes est principalement motivé par la motilité dirigée des cellules 4T1 du noyau vers le compartiment de bord et leur capacité à rester au bord, tandis que les cellules 67NR présentent une motilité aléatoire (diffusive), restant dans le même compartiment dans le temps. En résumé, nous avons montré que les différences de persistance entraînent le tri des cellules entre les cellules 4T1 et 67NR.

Alors que l'auto-organisation et la structuration des cellules sont largement étudiées dans les tissus embryonnaires et au cours du développement, jusqu'à présent, seules quelques études ont testé des mélanges de deux types de cellules ou plus dans le modèle sphéroïde du cancer19,20. La plupart des études ont rapporté que les cellules triaient sur la base de l'hypothèse d'adhésion différentielle, qui prédit le tri en fonction des différences d'adhérence intercellulaire, les cellules présentant les adhérences cellule-cellule les plus fortes étant positionnées au centre35. Sur la base de l'expression des cadhérines pour la paire 4T1 / 67NR, l'hypothèse d'adhésion différentielle prédit que dans un sphéroïde 3D, 4T1 exprimant la E-cadhérine se triera des cellules 67NR exprimant la N-cadhérine, avec les cellules 4T1 situées au centre et 67NR cellules qui les entourent. En revanche, nos données démontrent le schéma opposé (Fig. 2a, b), suggérant que l'hypothèse d'adhésion différentielle peut ne pas s'appliquer dans notre modèle. Pour confirmer cela, nous avons inhibé les jonctions cellule-cellule dans les cellules 4T1 via un anticorps bloquant la E-cadhérine (Fig. 3a). Fait intéressant, le blocage de la E-cadhérine n'a pas éliminé le tri cellulaire entre les cellules 4T1 et 67NR, mais l'a retardé d'un jour (Fig. 3b). Pour confirmer ce résultat, nous avons généré des lignées cellulaires stables d'E-cadhérine (Ecad-KD1 et Ecad-KD2; Fig. 3c – e). Selon l'analyse Western blot, la diminution de l'expression de la E-cadhérine était de 36,3 % pour Ecad-KD1 et de 96,8 % pour Ecad-KD2. Les deux lignées cellulaires Ecad-KD se sont séparées des cellules 67NR-GFP et se sont accumulées jusqu'au bord du sphéroïde au jour 3 après l'enrobage (Fig. 3g, h). Dans l'ensemble, cela suggère que, dans notre modèle, le tri cellulaire est indépendant de la E-cadhérine.

a Sphéroïdes mixtes, à un rapport de 1:50, imagés au jour 4 après l'enrobage. Les sphéroïdes ont été traités avec (+Ab, panneau de droite) ou sans (-Ab, panneau de gauche) un anticorps bloquant la E-cadhérine. Barre d'échelle : 100 µm. b DI pour les cellules 4T1-mScar (boîtes magenta) et 67NR-GFP (boîtes vertes) des sphéroïdes en (a). P = 2,78 × 10−5, <2,2 × 10−16 et 1,12 × 10−12 respectivement, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. c Cellules Ecad-CTL, Ecad-KD1 et -KD2 en 2D. La E-cadhérine (vert, panneaux inférieurs) et les noyaux (gris, panneaux supérieurs) sont affichés. d Densité intégrée du signal E-cadhérine des cellules en (c). P = 4,85 × 10−12 et <2,2 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. e Western-blot de l'expression de la E-cadhérine dans les cellules Ecad-CTL, -KD1 et -KD2. La β-actine est utilisée comme contrôle de charge. f Nombre de brins par sphéroïde (noir) et nombre de cellules individuelles par sphéroïde (bleu) pour les sphéroïdes Ecad-CTL, -KD1 ou -KD2. Les symboles rouges vides indiquent des valeurs nulles. P = 9,01 × 10−10, 1,06 × 10−3 et 1,74 × 10−5, par le test t. g Sphéroïdes mixtes, à un rapport de 1:50, imagés au jour 4 après l'enrobage. Des cellules Ecad-CTL, -KD1 ou -KD2 ont été utilisées. Barre d'échelle : 100 μm. h DI pour les cellules Ecad-CTL, -KD1 et -KD2 (boîtes magenta) et 67NR-GFP (boîtes vertes) de sphéroïdes en (g). P = 4,72 × 10−5, <2,20 × 10−16, 2,21 × 10−5, 2,12 × 10−15, 2,05 × 10−13 et <2,20 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Des transferts Western non recadrés sont disponibles dans les figures supplémentaires. S14–S15.

Étant donné que le tri cellulaire s'est produit au jour 3 après l'intégration (Fig. 2a, d) et que l'accumulation de cellules 4T1 au bord du sphéroïde a été maintenue tout au long de l'invasion 3D (Fig. 2i), nous avons estimé que l'interaction des cellules 4T1 avec l'ECM peut être critique pour le maintien du tri cellulaire. Pour tester cela, nous avons placé des sphéroïdes mixtes dans une matrice non adhérente composée d'agarose. Aux jours 3 et 4, le DI était similaire pour les cellules 4T1 et les cellules 67NR, démontrant que les cellules incluses dans l'agarose ne se triaient pas (Fig. 4a, b). La zone du noyau sphéroïde était similaire dans les matrices de collagène I et d'agarose, ce qui indique que la perte de tri cellulaire était indépendante de la prolifération cellulaire (Fig. S6a). Cette absence de tri cellulaire pourrait être due à l'échec des cellules 4T1 à rester au bord du sphéroïde sans l'ECM adhésif. Pour tester cela en temps réel, nous avons effectué une imagerie accélérée de sphéroïdes mixtes intégrés dans de l'agarose et suivi des cellules 4T1 individuelles (Fig. 4c; Film S7). Nous avons constaté que le ΔDI moyen pour les cellules initialement situées dans le compartiment de bord était négatif et proche de zéro pour les cellules initialement situées dans le compartiment central (Fig. 4d). Cela indique que les cellules 4T1 se déplacent du compartiment de bord sphéroïde dans le compartiment central (Film S8) et à l'intérieur du noyau (Film S7). Ces cellules 4T1, qui pénètrent dans le compartiment de bord, le quittent ensuite, ce qui n'a pas été observé dans les sphéroïdes intégrés dans la matrice de collagène I (Film S9). Fait intéressant, en calculant le MSD des cellules dans la direction radiale, nous avons constaté que la différence de persistance entre les cellules 4T1 (super-diffusives, α > 1) et 67NR (diffusives, α = 1) était maintenue (Figs. 4e et S6b– d), suggérant qu'une interface ECM adhésive est nécessaire pour le tri cellulaire.

a Sphéroïdes mixtes dans une matrice d'agarose imagés au jour 3 ou 4 après l'enrobage. Barre d'échelle : 100 µm. b DI pour les cellules 4T1-mScarlet (boîtes magenta) et 67NR-GFP (boîtes vertes) des sphéroïdes en (a). c Instantanés d'un enregistrement accéléré de 44 h d'un sphéroïde mixte cultivé dans une matrice de collagène I 3D. Les images ont été prises à 10 h (jour 0,5) et 54 h (jour 2,5) après l'enrobage. Pour plus de clarté, seules les cellules 4T1-mScarlet sont présentées. Les trajectoires cellulaires représentatives, codées par couleur en fonction du temps, sont affichées (panneaux de droite). Voir aussi Films S7–9. Barre d'échelle : 100 µm. d ΔDI pour les cellules 4T1-mScarlet des sphéroïdes en (c). P = 7,50 × 10−4, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. e L'exposant de la loi de puissance αr est indiqué pour les cellules 4T1-mScarlet (barres magenta) et 67NR-GFP (barres vertes) des compartiments de bord et de noyau. f Schéma (à gauche) du test de compétition cellule-ECM 2D et zoom avant sur les cellules présentes à l'interface gélatine/poly-L-lysine (PLL) 24 h après le placage (en haut, panneau de droite). Les cellules 4T1-mScarlet (en bas, à gauche) et 67NR-GFP (en bas, à droite) ont été étalées sur les îlots de gélatine uniquement. Voir aussi Film S10. Barre d'échelle : 200 µm. g Pourcentage de cellules 4T1-mScarlet (boîtes magenta) et 67NR-GFP (boîtes vertes) sur la poly-L-lysine (PLL) de (f). h Schéma de l'angle de contact (θ) (en haut) et vues orthogonales xz des cellules 4T1-mScarlet et 67NR-GFP sur poly-L-lysine (PLL) ou gélatine, 5 h après placage. Barre d'échelle : 5 µm. i Angle de contact θ pour les cellules de (h). PLL, 4T1 contre 67NR : P = 1,25 × 10−9 ; 4T1, PLL vs gélatine : P = 4,13 × 10−10, par le test de somme des rangs de Wilcoxon.

Cela nous a incités à émettre l'hypothèse que, par rapport aux cellules 67NR, les cellules 4T1 adhèrent préférentiellement à l'ECM. Pour comparer les propriétés adhésives des cellules 4T1 et 67NR à l'ECM, nous avons développé un test de compétition adhésive cellule-ECM 2D, dans lequel les deux types de cellules ont été étalés sur des îlots de gélatine circulaires (5,5 mm de diamètre), avec de la poly-L-lysine revêtement présent entre les îlots (Fig. 4f). Après 24 h, nous avons noté le nombre de cellules 4T1 et 67NR qui ont migré des îlots de gélatine vers la région recouverte de poly-L-lysine. Nous avons constaté que 85% des cellules présentes sur la région poly-L-lysine à 24 h étaient des cellules 67NR (Fig. 4g). Pour expliquer cela, nous avons analysé les films accélérés et avons constaté que dans le rare cas où des cellules 4T1 traversaient de la gélatine à la zone poly-L-lysine, les cellules finissaient par migrer vers la gélatine (Film S10). Nous nous sommes demandé si cela pouvait s'expliquer par le fait que les cellules 4T1 avaient une force d'adhésion à la gélatine plus élevée que les cellules 67NR. Pour tester cela, nous avons mesuré l'angle de contact des cellules étalées sur de la gélatine ou de la poly-L-lysine (Fig. 4h). Il a déjà été démontré que l'angle de contact cellule-matrice augmentait avec la force d'adhésion36. Nous avons constaté que les deux types de cellules avaient un angle de contact similaire lorsqu'ils étaient étalés sur de la gélatine (Fig. 4i). Cependant, les cellules 4T1 plaquées sur la poly-L-lysine avaient un angle de contact significativement plus faible, tandis que les cellules 67NR présentaient des valeurs d'angle de contact similaires sur la gélatine et la poly-L-lysine (Fig. 4i, indiquant que, par rapport aux cellules 67NR, les cellules 4T1 sont plus sensibles à la présence d'ECM. Cette affinité pour l'ECM est en ligne avec les niveaux plus élevés de FAK et de p-FAK observés dans les cellules 4T1 que dans les cellules 67NR (Fig. S6e). En analysant les contacts cellule-cellule entre 4T1 et Cellules 67NR étalées sur de la gélatine, nous avons constaté que le pourcentage de contacts homotypiques était similaire au moment de l'ensemencement (0 h) et à 24 h après l'ensemencement (Fig. S6f, g).Cela a confirmé que les cellules 4T1 et 67NR ne se triaient pas en 2D, confirmant une fois de plus que les adhérences différentielles entre les cellules ne sont pas le principal moteur du tri cellulaire dans notre système, et soulignant la nécessité d'une interface cellule-ECM pour initier le tri cellulaire35.

Après le tri des cellules 4T1 et 67NR dans des sphéroïdes aux jours 3 et 4, l'invasion s'est produite aux jours 5 et 6 (Figs. 2a, 5a et S4c). Un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses peuvent envahir collectivement est l'invasion coopérative : les cellules leader invasives créent des micropistes à l'intérieur de l'ECM, à travers lesquelles les cellules non invasives peuvent suivre18,19,20,21. Étant donné que les cellules 4T1 et 67NR présentent des compétences invasives différentielles, nous avons estimé que les cellules 4T1 pourraient permettre l'invasion coopérative des cellules 67NR non invasives. Pour tester cette hypothèse, nous avons analysé les sphéroïdes mixtes au jour 6 après l'enrobage. Nous avons observé que les cellules 67NR non invasives présentes dans les sphéroïdes mixtes pénétraient dans la matrice de collagène I (Fig. 5a). En conséquence, nous avons constaté que, par rapport aux sphéroïdes 67NR uniquement, les sphéroïdes mixtes avaient un nombre plus élevé de brins par sphéroïde (Fig. 5b) et environ un tiers des brins contenaient des cellules 67NR (Fig. 5c). Fait important, dans les sphéroïdes mixtes, la majorité des brins était dirigée par des cellules 4T1 (Fig. 5d), qui assemblent des invadopodes (Fig. 1h). Conformément à la dépendance à la MMP des cellules 4T1 pour l'invasion (Fig. 1a), GM6001 a bloqué l'invasion sphéroïde mixte (Fig. 4a – c). Au cours de l'invasion coopérative, le tri cellulaire entre les cellules 4T1 et 67NR a été maintenu dans les brins invasifs ainsi que dans le sphéroïde (Fig. 5e – g), les cellules 4T1 tapissant l'interface sphéroïde-matrice. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que l'invasion coopérative de sphéroïdes mixtes dans le collagène I dépend de la MMP, les cellules 4T1 assumant la position de leader.

a Sphéroïdes constitués de cellules simples ou mixtes (1:50) 4T1-mScarlet et 67NR-GFP, imagées au jour 6 après l'intégration. Les sphéroïdes ont été traités avec le contrôle DMSO (panneaux de gauche) ou GM6001 (panneau de droite). Barres d'échelle : 100 µm. Nombre de brins par sphéroïde (b), le nombre de brins contenant des cellules 67NR (67NR +) (c) et le pourcentage de brins dirigés par des cellules 4T1-mScarlet (boîtes magenta) ou 67NR-GFP (boîtes vertes) (d) pour les sphéroïdes simples ou mixtes (boîte blanche) de (a). Les symboles rouges vides indiquent des valeurs nulles. P = 1,90 × 10−7 (b) et 9,86 × 10−6 (c), par le test de somme des rangs de Wilcoxon. e Tranche médiane de sphéroïdes mixtes de (a). Barres d'échelle : 100 µm. f Coordonnées des cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (croix vertes) de sphéroïdes mixtes en (e). Les cellules présentes dans les brins ont été exclues (panneau de gauche) ou incluses (panneau du milieu) dans l'analyse. g DI pour les cellules 4T1-mScarlet (magenta) et 67NR-GFP (vert) des sphéroïdes en (e, f). P < 2,20 × 10−16 et <2,20 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. h Sphéroïdes de cellules Ecad-CTL, -KD1 ou -KD2 mélangées avec du 67NR à un rapport de 1:50, imagées au jour 6 après l'enrobage. Barre d'échelle : 100 μm. Nombre de brins (i) et nombre de brins contenant des cellules 67NR-GFP (67NR +) (j) pour les sphéroïdes de (h). P = 0,02 et 6,1 × 10−5 dans (i) ; 0,00073 et 8,70 × 10−8 en (j), par le test de somme des rangs de Wilcoxon. k Nombre de cellules individuelles trouvées à l'extérieur du noyau de sphéroïde, pour les sphéroïdes de (h). P = 0,02 et 6,1 × 10−5.

Jusqu'à présent, nos résultats suggèrent que la dégradation de l'ECM médiée par 4T1 est nécessaire pour que les cellules 67NR pénètrent dans la matrice de collagène I. Nous avons émis l'hypothèse que la présence de cellules 4T1 dans la matrice de collagène I est nécessaire et suffisante pour dégrader le collagène et créer des microtraces. Pour confirmer cela, au lieu de pré-mélanger des cellules 4T1 avec des cellules 67NR dans un sphéroïde, nous avons intégré des sphéroïdes 67NR dans une matrice de collagène I peuplée de cellules 4T1. Semblable à nos observations dans des sphéroïdes mixtes, nous avons constaté qu'en présence de cellules 4T1 dans la matrice de collagène I, les cellules 67NR envahissaient la matrice et que cette invasion était dépendante de la MMP (Fig. S7a, b). Pour exclure la possibilité que les MMP solubles libérées par les cellules 4T1 aient facilité l'invasion des cellules 67NR dans la matrice de collagène I, nous avons cultivé des sphéroïdes de cellules 67NR avec un milieu conditionné à partir de cellules 4T1. Nous avons constaté que fournir un milieu conditionné des cellules 4T1 aux cellules 67NR n'était pas suffisant pour que les cellules 67NR envahissent la matrice de collagène I (Fig. S7c, d). Dans les sphéroïdes mixtes, nous avons identifié des micropistes à l'intérieur de la matrice de collagène I, remplies de cellules 4T1 en tête et de cellules 67NR à la suite (Fig. S7e). Un précédent rapport d'une invasion coopérative hétérotypique entre des fibroblastes associés au cancer et des cellules cancéreuses épithéliales a démontré l'implication d'adhérences hétérotypiques N-cadhérine/E-cadhérine37. Nous n'avons pas détecté de jonctions hétérotypiques E-cadhérine / N-cadhérine entre les cellules 4T1 et 67NR (Fig. S8a – c), ce qui suggère que l'invasion coopérative entre ces cellules ne dépendait pas des interactions E- / N-cadhérine. Dans l'ensemble, nos données suggèrent que les cellules 4T1 dégradent la matrice de collagène I et que les cellules 67NR se déplacent dans les micropistes créées par les cellules 4T1.

Nous nous sommes demandé si l'inhibition de la E-cadhérine, qui n'avait aucun effet sur le tri cellulaire (Fig. 3f, g), pouvait affecter l'invasion coopérative. Pour tester cela, nous avons imagé les sphéroïdes 4T1, Ecad-CTL, -KD1 et -KD2 au jour 6, lorsque l'invasion se produit (Fig. 5h). Alors que la lignée cellulaire Ecad-KD1 a montré une transition partielle de l'invasion collective à l'invasion unicellulaire, avec des brins invasifs ainsi que des cellules invasives uniques, une transition complète vers l'invasion unicellulaire a été observée pour Ecad-KD2. De même, dans les sphéroïdes mixtes contenant des cellules 67NR avec Ecad-CTL ou -KD, tandis que les cellules Ecad-CTL et Ecad-KD1 formaient des brins invasifs, les deux lignées cellulaires Ecad-KD présentaient une invasion cellulaire unique (Fig. 5i – k). Pour quantifier les occurrences d'invasion coopérative dans les modes d'invasion collectifs et unicellulaires, nous avons mesuré le nombre d'adeptes de 67NR présents soit dans des brins (Fig. 5j), soit sous forme de cellules individuelles (Fig. 5k). Nos résultats démontrent que si 67NR peut suivre les cellules Ecad-KD1, qui maintiennent des brins invasifs (Fig. 5i), en présence d'une transition complète vers une invasion unicellulaire, comme dans les sphéroïdes mixtes d'Ecad-KD2 et 67NR, l'invasion coopérative est perdue. (Fig. 5k).

Étant donné que la dégradation de l'ECM médiée par 4T1 est nécessaire pour l'invasion coopérative (Fig. 4 et S6) et que la cellule leader 4T1 assemble les invadopodes (Fig. 1h), nous nous sommes demandé si l'assemblage spécifique des invadopodes par les cellules 4T1 était responsable de la dégradation de l'ECM. Pour confirmer rigoureusement que la fonction des invadopodes est requise pour l'invasion coopérative des cellules cancéreuses, nous avons éliminé de manière stable les invadopodes dans les cellules 4T1-mScarlet, en utilisant un knockdown de souris Tks5 (Tks5-KD) 13, et avons établi la lignée cellulaire de contrôle correspondante (Tks5-CTL) (Fig. 6a, en haut, 78,1 % d'efficacité de désactivation). Nous avons également vérifié que les lignées cellulaires Tks5-CTL et Tks5-KD exprimaient toujours la E-cadhérine (Fig. 6a, en bas), qui était localisée aux jonctions entre les cellules Tks5-CTL et Tks5-KD dans les sphéroïdes (Fig. S9a, b) . Nous avons confirmé par un test de dégradation de la gélatine en 2D et un test d'invasion de sphéroïdes en 3D que les cellules Tks5-KD avaient perdu leur capacité invasive (Fig. 6b – e). Nous avons ensuite effectué le test d'invasion sphéroïde de sphéroïdes mixtes contenant des cellules Tks5-CTL et Tks5-KD. Au jour 2 après l'enrobage, nous avons constaté que les cellules Tks5-CTL et les cellules Tks5-KD non invasives étaient entrées dans la matrice de collagène I (Fig. 6d). Les sphéroïdes mixtes avaient un nombre similaire de brins à Tks5-CTL (Fig. 6e), et la plupart des brins contenaient les deux types de cellules (Fig. 6f) et étaient dirigés par des cellules Tks5-CTL (Fig. 6g). Pour tester si l'invasion coopérative était spécifique au type de cellule, nous avons choisi la lignée cellulaire humaine métastatique MDA-MB-231, qui n'exprime pas la E-cadhérine et assemble des invadopodes fonctionnels13. En abattant Tks5 humain dans les cellules MDA-MB-231 (Fig. S10a – c), nous avons observé que les cellules sans invadopodes étaient capables de suivre les cellules avec des invadopodes, via une invasion coopérative (Fig. S10d – g), renforçant nos résultats. Pour tester davantage l'importance des invadopodes dans l'invasion coopérative des cellules cancéreuses, nous avons généré des sphéroïdes mixtes Tks5-KD et 67NR-GFP. Ici, nous n'avons pas observé de brins invasifs (Fig. 6h, i). Enfin, nous avons validé la conclusion avec une séquence shRNA Tks5 différente, Tks5-KD2, qui a fourni des résultats similaires à Tks5-KD (Fig. S11). Dans l'ensemble, nous démontrons que les invadopodes fonctionnels sont nécessaires dans les cellules leaders lors de l'invasion coopérative, tandis que les cellules suiveuses peuvent manquer d'invadopodes.

une expression de Tks5 (en haut) et de E/N-cadhérine (en bas) dans les cellules Tks5-CTL et Tks5-KD. b Dégradation de la gélatine par Tks5-CTL (panneau supérieur) et Tks5-KD (panneau inférieur), 18 h après le placage. Les encarts montrent un zoom avant 2X de la zone encadrée et les pointes de flèches indiquent une dégradation représentative. Barre d'échelle : 20 μm. c Zone de dégradation par cellule pour les cellules Tks5-CTL et Tks5-KD de (b). P < 2,2 × 10−16, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. d Images du jour 2 de sphéroïdes constitués de cellules Tks5-CTL, -KD ou d'un mélange de cellules Tks5-CTL et -KD (rapport 1: 1). Barre d'échelle : 100 μm. Nombre de brins par sphéroïde (e), nombre de brins contenant des cellules Tks5-KD (f) et pourcentage de brins dirigés par des cellules Tks5-CTL et -KD (g) dans les sphéroïdes de (d). P = 1,54 × 10−7 et 2,89 × 10−5, par le test de somme des rangs de Wilcoxon en (e). P = 6,69 × 10−11, par le test t en (f). h Images du jour 6 de sphéroïdes mixtes (rapport 1:50) constitués de cellules 67NR-GFP et 4T1-mSCarlet (4T1-mScar) ou Tks5-KD. Barres d'échelle : 100 μm. i Nombre de brins par sphéroïde de (h). P = 3,36 × 10−6, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. j Tumeur mixte 4T1-mScarlet et 67NR-GFP, marquée au DAPI (bleu). Barre d'échelle : 50 μm. k Nombre de colonies pulmonaires par cm2 pour les souris inoculées avec des cellules 4T1, 67NR, Tks5-CTL ou Tks5-KD. Les symboles rouges vides indiquent des valeurs nulles. P = 0,032, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. l Nombre de colonies pulmonaires par cm² pour les souris inoculées avec des cellules 67NR simples, ou mélangées avec des cellules 4T1 ; et des cellules Tks5-KD simples, ou mélangées avec des cellules Tks5-CTL. Les symboles rouges vides indiquent des valeurs nulles. P = 0,032, par le test de somme des rangs de Wilcoxon. Des transferts Western non recadrés sont disponibles dans les figures supplémentaires. S16–S18.

Nous avons également testé si la suppression des invadopodes affectait le tri cellulaire. Comme prévu, le tri cellulaire ne s'est pas produit dans les sphéroïdes mixtes de cellules Tks5-CTL et Tks5-KD (Fig. S12a), mais il s'est produit dans les sphéroïdes contenant des cellules Tks5-KD et 67NR-GFP (Fig. S12b). Ces résultats ont confirmé que les invadopodes ne sont pas nécessaires pour le tri cellulaire. Étant donné que les cellules Tks5-CTL et Tks5-KD présentent des propriétés de motilité et d'adhésion cellule-ECM similaires (Fig. S12c, d), ces observations renforcent également l'exigence d'une motilité différentielle et d'une sensibilité différentielle cellule-ECM pour que le tri cellulaire se produise. Conformément à cela, le tri cellulaire ne s'est pas produit dans les sphéroïdes contenant des cellules de type sauvage 4T1-mScarlet et 4T1 (Fig. S12e, f).

La dissémination et la métastase nécessitent une migration transendothéliale des cellules cancéreuses, c'est-à-dire une intravasation et une extravasation, dont il a été précédemment démontré qu'elles étaient dépendantes des invadopodes13,38. Alors que la MEC interstitielle dans la tumeur primaire et les tissus environnants peut être remodelée de façon permanente par la formation de microtraces39, la migration transendothéliale implique une ouverture brève et transitoire de la MEC périvasculaire40. On ne sait pas si les cellules invasives et non invasives peuvent également coopérer pendant la métastase. Pour déterminer si les cellules avec des invadopodes pouvaient permettre la métastase de cellules sans invadopodes, nous avons généré des tumeurs avec des lignées cellulaires simples ou mixtes. Après que les tumeurs aient atteint 6 à 9 mm de diamètre, nous avons effectué le test clonogénique pulmonaire sur les tissus digérés. Pour déterminer quel type de cellule développait des colonies pulmonaires métastatiques, nous avons exploité les différences d'expression de protéines fluorescentes ou de sensibilité aux médicaments. Nous avons confirmé que l'inactivation de Tks5 était maintenue dans les tumeurs Tks5-KD (Fig. S11i). Nous avons constaté que les lignées cellulaires Tks5-KD, en arrière-plan 4T1 ou MDA-MB-231, et les cellules 67NR n'étaient pas capables de métastases pulmonaires, contrairement aux cellules témoins et de type sauvage (Figs. 6k et S10i, S11j). Lorsque les cellules 4T1 et 67NR ont été co-injectées, 67NR n'a pas métastasé (Fig. 6l). Cela n'était pas dû à la prise de contrôle des cellules 4T1, car des cellules 67NR étaient présentes dans le tissu tumoral (Fig. 6j). De même, la co-injection du contrôle MDA-MB-231 et de son knock-down Tks5 correspondant, D2-KD, a démontré que seules les cellules témoins étaient capables de métastases (Fig. S10h, i). Fait intéressant, lorsque Tks5-KD a été co-injecté avec des cellules Tks5-CTL, les deux types de cellules ont été observés dans les poumons (Fig. 6l), ce qui suggère qu'une métastase coopérative s'est produite. Collectivement, ces résultats impliquent la dépendance des métastases coopératives sur les invadopodes et sur l'expression de la E-cadhérine et/ou la présence de jonctions cellule-cellule.

Dans cette étude, nous montrons que les cellules invasives peuvent trier et diriger des cellules non invasives lors d'une invasion et d'une métastase coopératives. En examinant les mouvements cellulaires dans les sphéroïdes, nous démontrons que la persistance différentielle et la sensibilité de l'ECM conduisent le tri cellulaire entre les clones. Grâce à l'élimination des invadopodes, en faisant taire Tks5, nous démontrons que les cellules avec des invadopodes dirigent les cellules sans invadopodes dans l'invasion coopérative et permettent leur métastase.

Nous confirmons les observations rapportées précédemment selon lesquelles les cellules invasives 4T1 sont dans un état épithélial/mésenchymateux hybride, tandis que les cellules 67NR non invasives sont mésenchymateuses27,28,29. Il a été précédemment montré que l'expression de Twist, nécessaire à l'invadopodia8, est présente dans les cellules 4T1 mais pas dans les cellules 67NR41. Par conséquent, l'EMT médiée par Twist pourrait être responsable des différences de compétences d'invasion entre les cellules 4T1 et 67NR41. Étant donné que les cellules 4T1, mais pas les cellules 67NR, assemblent des invadopodes fonctionnels, il semble qu'une trajectoire EMT spécifique d'octroi d'invadopodes, plutôt que l'achèvement de l'EMT, soit nécessaire pour l'émergence des invadopodes. Nos résultats sont conformes aux preuves récentes selon lesquelles les cellules épithéliales3,42 et les cellules épithéliales/mésenchymateuses hybrides peuvent métastaser, parfois plus efficacement que les cellules mésenchymateuses43,44.

Malgré l'expression de la cortactine et de Tks5, les composants centraux des invadopodes, les cellules 67NR ne parviennent pas à dégrader la matrice. Cependant, les cellules 67NR manquent de MMP-2 et MMP-9 actifs, probablement en raison de MMP-14 (également connu sous le nom de MT1-MMP), la protéase généralement chargée d'activer MMP-2 et MMP-9, n'est pas fonctionnelle, ou non. étant livré à la membrane plasmique45,46.

Ici, nous découvrons le rôle de la persistance différentielle et de la sensibilité cellulaire-ECM dans l'établissement du tri cellulaire dans le cancer. Des études classiques sur le tri cellulaire au cours du développement ont montré que le tri cellulaire repose généralement sur la force différentielle des adhérences cellule-cellule35 ou sur les différences de contractilité47. En contradiction avec ces points de vue, nous montrons que les cellules 4T1 et 67NR ne se triaient pas sur une couche de gélatine 2D ou lorsqu'elles étaient placées dans une matrice d'agarose 3D. L'importance de la motilité différentielle dans le tri a déjà été suggérée lors de la structuration des tissus48 et dans les tubules mammaires modifiés, où il a été démontré que des cellules épithéliales plus directionnelles s'accumulent au bord des tissus49. Au cours de l'auto-organisation des canaux mammaires, la présence d'interactions binaires cellule-ECM (activées ou désactivées) a été signalée pour réguler le tri cellulaire36. Semblable à nos observations, Pawlizak et al. ont récemment démontré que le tri des lignées cellulaires mammaires exprimant la E-, N- ou P-cadhérine ne pouvait pas être expliqué par l'hypothèse d'adhésion différentielle50. Fait intéressant, les auteurs ont proposé que la motilité puisse être responsable du tri cellulaire.

Nous constatons que dans les sphéroïdes où des cellules invasives hautement persistantes sensibles à l'ECM sont mélangées à des cellules non invasives se déplaçant au hasard, le tri et l'accumulation de cellules invasives à l'interface sphéroïde-ECM précèdent l'invasion coopérative. Cela souligne l'importance d'étudier les mécanismes régulant l'organisation spatiale des cellules leaders et suiveuses. L'accumulation de cellules leaders à l'interface sphéroïde-matrice peut améliorer la vitesse et l'efficacité de l'invasion coopérative. À l'appui de ces points de vue, une étude récente a démontré que le tri cellulaire précède l'extrusion basale des cellules épithéliales mammaires51. Fait important, alors que le tri cellulaire peut être catalytique, il ne semble pas être essentiel pour la métastase coopérative dans notre système. Alors que les cellules mixtes 4T1 Tks5-KD et Tks5-CTL s'engagent dans des métastases coopératives, mais ne se trient pas, les mélanges de cellules 4T1 et 67NR se trient mais ne métastasent pas de manière coopérative.

Depuis la découverte de l'invasion coopérative, des travaux importants ont été menés pour découvrir les mécanismes par lesquels les populations hétérogènes de cellules cancéreuses du sein interagissent et se mobilisent collectivement. Nos travaux suggèrent que l'activité des invadopodes est un déterminant du phénotype de la cellule leader. Nous avons précédemment montré que la phase G1 du cycle cellulaire est également un déterminant de l'identité de la cellule leader22. Conformément à ce présent travail, nous avions également prouvé que les invadopodes sont enrichis dans la phase G1 du cycle cellulaire22. Une étude différente a révélé que les cellules menant les brins d'invasion possèdent une énergie intracellulaire plus élevée que les cellules suiveuses17. Au total, il semble que le cycle cellulaire, l'énergie intracellulaire et la fonction des invadopodes soient des déterminants de l'identité de la cellule leader. Cependant, l'interaction entre le cycle cellulaire, l'énergie intracellulaire et la fonction des invadopodes n'a pas encore été étudiée dans le contexte de l'émergence de leaders et de suiveurs au sein d'une population cellulaire.

En résumé, notre étude suggère que la coopérativité entre les clones de cancer peut être un mécanisme efficace pour les métastases collectives. Plus précisément, nous démontrons que les invadopodes permettent la métastase coopérative et permettent aux cellules non invasives de métastaser. Nos découvertes sur les métastases coopératives de 4T1 Tks5-KD avec Tks5-CTL sont conformes à la démonstration précédente de la dissémination des grappes de cellules épithéliales3. En revanche, les cellules 67NR ne métastasent pas de manière coopérative lorsqu'elles sont mélangées avec 4T1. De plus, les cellules MDA-MB-231 Tks5-KD (D2-KD) ne métastasent pas en coopération avec les cellules MDA-MB-231. Ces deux lignées cellulaires manquent d'E-cadhérine, ce qui suggère que la métastase coopérative dépend de fortes interactions cellule-cellule à base d'E-cadhérine. Fait intéressant, l'invasion coopérative dans le test de sphéroïde 3D ne pose pas une telle exigence, car les cellules 67NR et D2-KD suivent avec succès leurs homologues invasifs. La raison probable est que les déformations du collagène générées par les cellules leader invasives sont plastiques (permanentes), permettant à des brins cellulaires ou à des cellules individuelles de migrer à travers eux39. En revanche, les déformations que les cellules leaders génèrent sur la paroi des vaisseaux sanguins sont élastiques (transitoires) et les suiveurs ne peuvent traverser les parois des vaisseaux sanguins que s'ils présentent de fortes adhérences cellule-cellule au leader.

Nos résultats démontrent que les cellules cancéreuses s'engagent dans des métastases coopératives, ce qui peut être plus préjudiciable que les métastases de cellules individuelles. Nous proposons que le ciblage des invadopodes pourrait être une stratégie puissante pour inhiber les métastases des cellules envahissantes à la fois individuellement13,14 et collectivement.

Toutes les expériences sur des souris (Mus musculus) ont été menées conformément aux réglementations NIH et approuvées par le numéro de protocole 4766 de l'IACUC de l'Université Temple.

Les dispositifs d'imagerie sphéroïde (SID) ont été fabriqués comme décrit précédemment33. En bref, les SID ont été fabriqués en liant des disques de poly-diméthyl-siloxane (PDMS) aux plats à fond de verre (MatTek Corporation). Chaque disque PDMS mesure 17,5 mm de diamètre et contient trois puits de 5,5 mm de diamètre, adaptés aux sphéroïdes individuels.

Des plaques à 6 puits ont été recouvertes de gélatine comme décrit précédemment52. En bref, chaque puits a été recouvert d'une solution de gélatine à 2, 5% pendant 10 min, suivi d'un traitement avec du glutaraldéhyde à 0, 5% (Sigma-Aldrich) pendant 10 min, sur de la glace, et 30 min supplémentaires à température ambiante. Les plaques ont été stérilisées par de l'éthanol à 70 %, puis 50 U/mL de pénicilline - 50 µg/mL de traitement à la streptomycine.

Les lignées cellulaires de cancer du sein murin isogénique 4T1 et 67NR étaient des dons du Dr Fred R. Miller du Karmanos Cancer Center et du Dr Jin Yang de l'UCSD. La lignée cellulaire de cancer du sein humain MDA-MB-231 (HTB-26) a été obtenue auprès de l'American Type Culture Collection. La lignée cellulaire MDA-MB-231-Dendra2-hTks5 KD a été décrite précédemment et a été maintenue sous une pression continue de 0,5 µg/ml de puromycine et de 500 µg/ml de généticine13. Toutes les cellules ont été cultivées dans du milieu d'aigle modifié de Dulbecco [4,5 g/L D-glucose, L-glutamine] (DMEM, Gibco), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS, Atlanta Biologicals) et de pénicilline 50 U/mL - 50 µg /mL de streptomycine (Gibco). Les cultures cellulaires ont été maintenues à 37 °C et 5 % de CO2 pendant un maximum de 60 jours.

Les lignées cellulaires 4T1-mScarlet et 67NR-GFP ont été générées par transfection en utilisant un rapport 1:4 d'ADN plasmidique: réactif FugeneHD (Promega), selon les instructions du fabricant, suivi d'une sélection avec 500 µg/mL de généticine (Fisher BioReagents) et 3 µg/mL de puromycine (MP Biomedicals), respectivement. pmScarlet-H-C1 était un cadeau de Dorus Gadella (plasmide Addgene # 85043). pEGFP-puro était un cadeau de Michael McVoy (plasmide Addgene # 45561). La lignée cellulaire MDA-MB-231-mScarlet a été générée par électroporation (Lonza) du plasmide pmScarlet-C1, selon les instructions du fabricant, et sélection avec 500 µg/ml de généticine. Après deux semaines de sélection de médicaments, les cellules ont été triées (BD FACSAriaIIµ, BD Biosciences), recueillant les sous-populations exprimant des niveaux élevés de mScarlet ou de GFP.

Les lignées cellulaires knockdown Tks5-KD et -KD2, E-cadhérine-KD1 et -KD2, et les lignées cellulaires témoins knockdown Tks5-CTL, Ecad-CTL et MDA-MB-231-mScarlet-CTL ont été générées par transduction du 4T1 -Lignées cellulaires mScarlet, 4T1 et MDA-MB-231-mScarlet, respectivement, avec des particules lentivirales (3 particules virales/cellule) contenant du shRNA ciblant mTks5 (Clone ID : TRCN0000105733, CTGGTGGTGTCCAACTATAA ; Clone ID : TRCN0000105734, CCTCATACATTGACAAGCGCA), hTks5 décrit précédemment13 , ou E-cadhérine (KD) (Clone ID : TRCN0000042581, CCGAGAGAGTTACCCTACATA ; Clone ID : TRCN0000042579, CGGGACAATGTGTATTACTAT) ou shRNA non ciblant (CTL) dans le vecteur pLKO.1-puro (Bibliothèque MISSION, Sigma-Aldrich), et sélection avec 2 µg/mL de puromycine 3 à 7 jours après l'infection. Les Western blots ont été analysés pour confirmer les efficacités de KD. De plus, des images d'Ecad-CTL et d'Ecad-KD immunomarquées avec de la E-cadhérine et segmentées à l'aide de Cellpose. Des masques ont été superposés sur l'image et la densité intégrale par cellule a été quantifiée.

La coloration au cristal violet a été utilisée pour évaluer l'effet de la mitomycine C sur la prolifération de la lignée cellulaire 4T1. Brièvement, les cellules 4T1 ont été ensemencées dans une plaque à 6 puits et le lendemain, le milieu de culture a été remplacé par un milieu de culture contenant 0,5 µg/mL de mitomycine C (remis en suspension dans du DMSO, Cayman Chemical). Après 2 jours, les cellules ont été lavées avec du PBS froid, fixées avec du méthanol à 100 % glacé pendant 10 min et colorées avec une solution de cristal violet à 0,5 % dans du méthanol à 25 % pendant 10 min à température ambiante. L'excès de colorant a été éliminé par plusieurs lavages à l'eau du robinet et la plaque a été séchée à l'air pendant une nuit à température ambiante. Le colorant a été solubilisé en utilisant du méthanol à 100 % pendant 20 min et la densité optique a été lue sur un lecteur de plaque à 570 nm. La densité optique à 570 nm pour les cellules traitées à la mitomycine C a été rapportée à la densité optique à 570 nm pour les cellules traitées au DMSO.

La gélatine a été marquée par fluorescence avec l'ester Alexa-405-NHS et des plats à fond de verre de 35 mm (MatTek Corporation) ont été recouverts d'Alexa-405-gélatine comme décrit précédemment31. 400 000 (4T1/67NR) ou 300 000 (MDA-MB-231) cellules ont été étalées par boîte et les cellules ont été fixées 18 h plus tard avec 4 % de paraformaldéhyde (Alfa Aesar) pendant 10 min, perméabilisées avec 0,1 % de Triton X-100 (Calbiochem) pendant 5 min, bloqué avec 1% FBS/1% BSA (Sigma-Aldrich) dans du PBS (Gibco) pendant 3 h, incubé avec un anticorps anti Tks5 (Millipore, MABT336) pendant 2 h, puis avec un anticorps secondaire et Alexa Fluor 633 Phalloidin (Invitrogen) pendant 1 h.

Les échantillons ont été imagés sur un microscope confocal à balayage laser (FV1200, Olympus) à l'aide d'un objectif 60X (UPLSAPO60XS, 1,35 NA, Olympus). Les piles ont été collectées à 1 µm z-step. Pour quantifier la dégradation de la matrice, les images ont été traitées à l'aide d'une macro personnalisée aux Fidji. En bref, les tranches de la pile ont été projetées en z à l'aide de la méthode Max Intensity, suivie d'un seuillage du signal dans le canal de gélatine, à l'aide de l'algorithme de seuil automatique, et de la mesure de la zone des points de dégradation à l'aide de l'outil d'analyse de particules. Pour tenir compte des différences de densité cellulaire dans les champs de vision, la surface totale de dégradation dans un champ de vision a été divisée par le nombre total de cellules présentes dans ce champ de vision. Les cellules ont été comptées en utilisant la coloration F-actine.

Des plaques à 6 puits ont été recouvertes de 50 µg/ml de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) pendant 20 minutes et séchées à l'air. Les cellules ont été étalées et cultivées jusqu'à confluence avant qu'une pointe de pipette de 10 ul ne soit utilisée pour créer une plaie en forme de croix à travers la monocouche. Les échantillons ont été imagés sur un microscope à champ large (IX-81, Olympus) équipé d'une lampe LED (Excelitas Technologies), d'une caméra à dispositif à couplage de charge Orca 16 bits (Hamamatsu), d'une compensation automatisée de dérive z IX3-ZDC (Olympus) , une étape automatisée (Prior Scientific), une chambre environnementale (Live Cell Instrument) et utilisant un objectif 10X (MPlanFL N 10X, 0,3 NA, Olympus). La motilité cellulaire a été enregistrée à des intervalles de 10 min pendant 48 h. Le suivi manuel des cellules a été effectué à l'aide du plugin TrackMate via Fiji53. Le numéro de piste, les coordonnées du point et le numéro de trame ont été exportés. Le calcul de la vitesse et de la persistance a été effectué à l'aide d'un code Matlab personnalisé.

Pour générer des îlots de gélatine, nous avons utilisé les inserts PDMS (voir Fabrication des dispositifs d'imagerie sphéroïde (SID)). En bref, des plats à fond de verre de 35 mm (MatTek Corporation) ont été recouverts de 50 ug/ml de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) pendant 20 min et séchés à l'air. Ensuite, des anneaux de PDMS ont été délicatement placés sur le dessus du verre et scellés en appuyant doucement. Ensuite, chaque trou de 5,5 mm de diamètre a été recouvert de gélatine marquée par fluorescence comme décrit précédemment31 (voir test de dégradation de la gélatine 2D). Des cellules 4T1-mScarlet et 67NR-GFP ont été plaquées dans chaque trou à un rapport de 1 à 1. Les cellules ont été autorisées à adhérer pendant 1 h, après quoi les inserts PDMS ont été délicatement décollés du verre et du milieu a été ajouté aux boîtes. Enfin, les cellules ont été fixées 24 h plus tard avec du paraformaldéhyde à 4 % (Alfa Aesar) pendant 10 min.

Les échantillons ont été imagés sur un microscope à champ large (Eclipse Ti2-E, Nikon) équipé d'une caméra pco.panda sCMOS (PCO) et en utilisant un objectif 10X (CFI Plan Fluor 10X, 0,3 NA, Nikon). Des tuiles (6 × 6) ont été acquises pour visualiser toute la surface de l'îlot de gélatine. Les cellules vivantes ont été imagées toutes les 10 minutes et à l'aide d'une chambre environnementale (Tokai Hit). Le film a été annoté à l'aide du plugin DrawArrowInMovie Fiji54. Pour quantifier le test de compétition adhésive cellule-ECM 2D, nous avons compté le nombre de cellules 4T1 et 67NR qui ont migré hors des îles de gélatine. Pour quantifier le tri cellulaire en 2D, nous n'avons utilisé que des régions recouvertes de gélatine et nous avons compté le nombre de voisins homotypiques.

La mesure de l'angle de contact a été effectuée comme décrit précédemment36. En bref, des plats à fond de verre de 35 mm (MatTek Corporation) ont été recouverts de gélatine marquée par fluorescence comme décrit précédemment31 ou avec 50 µg/ml de poly-L-lysine (Sigma-Aldrich) pendant 20 min et laissés sécher à l'air. Les cellules ont été laissées adhérer pendant 5 h avant l'imagerie. Les cellules solitaires, qui n'avaient aucune interaction physique avec les cellules voisines, ont été imagées sur un microscope confocal à balayage laser (FV1200, Olympus) à l'aide d'un objectif 60X (UPLSAPO60XS, 1,35 NA, Olympus) équipé d'une chambre environnementale (In Vivo Scientific), avec un Pas de z de 1 µm. Les vues orthogonales ont été utilisées pour mesurer l'angle entre l'ECM et le corps principal de la cellule : l'angle de contact.

Pour les lignées cellulaires 4T1 et 67NR, des sphéroïdes 3D ont été générés par la méthode de la goutte suspendue. 3000 cellules par goutte de 40 µl contenant 4,8 mg/mL de méthylcellulose (Sigma-Aldrich), 20 µg/mL de Nutragen (Advanced Biomatrix), ont été placées sur le couvercle des boîtes de culture tissulaire. Les couvercles ont été soigneusement tournés et placés sur le réservoir inférieur des boîtes remplies de PBS pour éviter l'évaporation. Alternativement, pour les lignées cellulaires MDA-MB-231, des sphéroïdes 3D ont été générés dans une boîte à fond en V à 96 puits recouverte de 0, 5% de poly (2-hydroxyéthyl méthacrylate) (Sigma-Aldrich) dans de l'éthanol. Ensuite, 5000 cellules dans 50 µl de milieu ont été distribuées dans chaque puits et la plaque a été centrifugée pendant 20 min à 1000 × g et à 4 °C. Enfin, 50 µl de Matrigel (Corning) ont été ajoutés à chaque puits à une concentration finale de 2,5 %. Les sphéroïdes ont été formés sur 3 jours à 37 ° C et 5 % de CO2, intégrés dans 30 µl de 5 mg/mL de collagène de queue de rat I (Corning, protocole de gélification alternatif) et placés dans les SID. Le collagène I a été polymérisé à 37 °C pendant 30 min, puis le milieu de culture a été ajouté aux boîtes. Pour les traitements médicamenteux, un milieu de culture cellulaire contenant 25 µM de GM6001 (remis en suspension dans du DMSO, Cayman Chemical), 10 µM de Y-27632 (remis en suspension dans du DMSO, Cayman Chemical) ou un contrôle à 0,1 % de DMSO a été utilisé.

Pour les expériences où les cellules 4T1-mScarlet entourent les sphéroïdes 67NR-GFP, des cellules 4T1-mScarlet ont été ajoutées au mélange de collagène contenant les sphéroïdes 67NR-GFP à 106 cellules/mL avant la polymérisation du collagène.

Pour les expériences où un milieu conditionné a été utilisé, des cellules 4T1-mScarlet ont été ensemencées sur une plaque à 6 puits recouverte de gélatine, à raison de 2 × 106 cellules/puits. 2 ml de DMEM complet ont été utilisés par puits et les sphéroïdes 67NR-GFP intégrés ont été cultivés, à partir du jour 0, en utilisant le milieu conditionné des cellules 4T1-mScarlet étalées sur de la gélatine. Tous les deux jours, le milieu conditionné était remplacé.

Le collagène a été marqué comme décrit précédemment55, en utilisant 2 µg/ml d'ester 405-Alexa-NHS (Biotium).

Pour bloquer la E-cadhérine, 5 μg/ml de l'anticorps bloquant (MABT26, Millipore) ont été utilisés pour rompre les adhérences cellule-cellule. Les sphéroïdes Ecad-KD ont été générés comme décrit précédemment19. En bref, les cellules ont été trypsinisées et remises en suspension à 1,5 × 104 cellules/ml dans du milieu DMEM F12 complet (5 % de sérum de cheval, 0,5 µg/ml d'hydrocortisone, 20 ng/ml de hEGF, 10 µg/ml d'insuline, 100 ng/ml de toxine cholérique , 1 % pénicilline/streptomycine) et 0,25 % méthylcellulose (Sigma-Aldrich). La suspension cellulaire a été ensemencée dans des plaques 96 puits à fond rond non adhésives (Corning), 200 μl/puits. La plaque a été centrifugée à 1000 tr/min pendant 5 min à température ambiante et placée sur l'agitateur orbital à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 2 h. Le milieu a été remplacé par un DMEM F12 complet contenant 0,25% de méthylcellulose (Sigma-Aldrich) et 1% de Matrigel (Corning). Les sphéroïdes ont été formés dans l'incubateur pendant 48 h.

Le marquage par immunofluorescence a été effectué comme décrit précédemment33. En bref, les sphéroïdes intégrés ont été simultanément fixés et perméabilisés dans du paraformaldéhyde à 4 % et du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 5 min, puis fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS pendant 20 min et bloqués dans du FBS à 1 %/BSA à 1 % dans du PBS à 4 °C pendant 24 h sur un agitateur. Les sphéroïdes inclus ont ensuite été incubés avec l'anti-collagène I ¾ (immunoGlobe, 0207-050 ; 1 à 100), l'anti E-cadhérine (Invitrogen, 13-1900 ; 1 à 100), l'anti N-cadhérine (BD Transduction Laboratories, 610920 ; 1 à 100) et anti Tks5 (Millipore, MABT336 ; 1 à 100) pendant une nuit à 4 °C et avec des anticorps secondaires et Alexa Fluor 633 Phalloidin (Invitrogen ; 1 à 250) pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur.

Les sphéroïdes ont été imagés à l'aide d'un microscope confocal à balayage laser (FV1200, Olympus) avec un objectif 10X (UPLXAPO10X, 0,4 NA, Olympus) ou 30X (UPLSAPO30XSIR, 1,05 NA, Olympus), en utilisant un pas de z de 3 à 5 µm. Pour quantifier la surface sphéroïde totale, les sphéroïdes ont été étiquetés avec du DAPI. Les images ont été traitées à l'aide d'une macro personnalisée à Fidji. En bref, les tranches ont été projetées en z à l'aide de la méthode Max Intensity et les noyaux ont été sélectionnés à l'aide de l'algorithme Automatic Threshold de Fidji. Ensuite, l'outil d'analyse de particules a été utilisé pour mesurer la surface totale des noyaux.

Pour quantifier le signal de la E-cadhérine, les tranches d'intérêt ont été projetées en z à l'aide de la méthode Max Intensity et des brins ou des cellules individuelles ont été identifiés. Pour le rapport relatif jonction/cytosol : une ligne de 10 µm de long a été tracée et centrée à la jonction entre deux cellules au sein d'un brin. La valeur de gris le long de la ligne a été mesurée pour le canal E-cadhérine et F-actine à l'aide de l'outil Plot Profile. La valeur de gris à 0 et 5 µm a été définie comme le signal "cytosol" et "jonction", respectivement.

Pour quantifier le tri des cellules, les images ont été traitées à l'aide d'une macro personnalisée aux Fidji. Étant donné que la projection maximale des tranches z introduit des artefacts dans les positions des cellules, en ce qui concerne le bord sphéroïde par rapport aux compartiments centraux, nous avons utilisé la tranche médiane de la pile z uniquement. En bref, la tranche médiane a été extraite de la pile z et le noyau sphéroïde a été sélectionné dans le canal à fond clair à l'aide de l'algorithme de seuil automatique de Fidji. Ensuite, à l'aide des options Fit Ellipse et Centroid dans Measurements, les coordonnées du centre du noyau sphéroïde et du grand axe du noyau sphéroïde ont été extraites. Enfin, l'outil Multi-point a été utilisé pour enregistrer les coordonnées des cellules GFP + et mScarlet +. Le tri cellulaire a été quantifié comme la distance entre le centre du sphéroïde et la cellule (d sur la figure 2c) sur le demi-grand axe du sphéroïde (a sur la figure 2c). Nous avons défini ce ratio comme le "Distance Index" (DI). Alternativement, pour les sphéroïdes mixtes contenant des cellules non marquées, telles que les cellules Tks5-CTL (Fig. 6) ou 4T1 de type sauvage (Fig. S12), la coloration DAPI a été utilisée pour mesurer la coordonnée d'une cellule. Pour une cellule suivie donnée, nous avons défini le ΔDI comme le DI pour sa position finale moins le DI pour sa position initiale.

L'imagerie en direct des sphéroïdes a été réalisée soit longitudinalement (quotidiennement), pour analyser le tri cellulaire, soit par time-lapse, pour analyser la motilité cellulaire. Un microscope confocal (FV1200, Olympus) utilisant un objectif 10X (UPLXAPO10X, 0,4 NA, Olympus) équipé d'une chambre environnementale (instrument Live Cell) a été utilisé. La motilité cellulaire a été enregistrée à des intervalles de 10 ou 20 minutes sur 44 h, avec un z-step de 15 µm. Seules les tranches où les cellules du noyau et les compartiments de bord étaient visibles ont été utilisées pour le suivi. Le suivi des cellules a été effectué à l'aide du plugin TrackMate via Fiji53. La détection ponctuelle a été effectuée à l'aide du détecteur LoG avec filtrage médian et localisation des sous-pixels. Ensuite, le tracker LAP à mouvement linéaire a été utilisé pour relier les spots. Les pistes ont été filtrées en fonction du nombre de spots dans la piste avec une coupure ≥ 5 spots/piste. Les pistes ont été validées visuellement et corrigées si nécessaire, à l'aide de l'outil TrackScheme. Enfin, les lacunes dans les pistes ont été comblées en introduisant de nouveaux spots. La nouvelle position des spots a été calculée par interpolation linéaire. Pour chaque piste, la distance entre la tache d'origine et l'interface sphéroïde-collagène I a été mesurée et si cette distance était ≤ 30 µm, la piste était classée comme bord, sinon la piste était classée comme noyau. Le numéro de piste, les coordonnées du point et le numéro de trame ont été exportés. Le calcul de l'indice de distance a été effectué à l'aide d'un code Matlab personnalisé (disponible sur demande).

Les coordonnées des trajectoires cellulaires individuelles ont été obtenues par suivi des particules avec l'origine de chaque sphéroïde à (0,0) et ont été transformées du système de coordonnées polaires cartésiennes {x, y} à {r, ϕ}. Les déplacements au carré moyens (MSD) ont ensuite été calculés dans les directions radiale et angulaire, moyennés sur différents sphéroïdes et répétitions expérimentales pour différentes conditions. Les données MSD ont ensuite été ajustées à une loi de puissance, dans les deux sens, à savoir

et

où \(({r}_{0},{\phi }_{0})\) correspond à l'origine de chaque trajectoire dans le système de coordonnées polaires, \({\Gamma }_{r,\phi }\ ) correspondent aux amplitudes des lois de puissance, et \({\alpha }_{r,\phi }\) sont les exposants, respectivement dans les directions radiale et angulaire. Les données MSD ont été ajustées à ces lois de puissance à l'aide de l'algorithme de Levenberg-Marquart, avec la plage d'ajustements dans l'intervalle [0, 3 h]. Notez que la motilité des cellules est sous-diffusive pour α < 1, diffusive pour α = 1 et super-diffusive pour α > 1.

Dans la direction radiale, étant donné que le mouvement s'est avéré super-diffusif, nous avons également calculé le coefficient de diffusion effectif dépendant du temps donné par56

résultant en

Il est important de noter que, pour un mouvement non diffusif, dépendant du temps \({{{{{{\rm{D}}}}}}}_{{{{{\rm{eff}}} }}}}\left(t\right)\) est le seul moyen d'estimer un coefficient de diffusion avec les unités correctes et de comparer différents ensembles de données de manière cohérente, tant que les mêmes points temporels sont choisis pour la comparaison.

Les cellules ont été étalées sur des boîtes recouvertes de poly-L-lysine et cultivées à 80 % de confluence. Les cellules ont été récoltées dans un tampon de lyse RIPA glacé (Teknova), additionné d'inhibiteurs de protéase (cocktail complet, Roche) et d'inhibiteurs de phosphatase (cocktail Halt, Sigma-Aldrich). La SDS-PAGE a été réalisée avec 20 µg de protéine par échantillon, transférée sur une membrane de difluorure de polyvinylidène (Immobilon), bloquée avec 5 % de BSA/TBST pendant 3 h à température ambiante et incubée avec de l'anti-β-actine (Santa Cruz Biotechnology, sc- 47778 ; 1 à 500), anti-cortactine (Abcam, ab33333 ; 1 à 1000), anti-E-cadhérine (BD Transduction Laboratories, 610181 ; 1 à 1000), anti-FAK (Santa Cruz Biotechnology, sc-271126, 1 à 100), anti-phospho-FAK (Tyr397) (Invitrogen, 44625 G, 1 à 100) anti-N-cadhérine (BD Transduction Laboratories, 610920 ; 1 à 500) et anti-Tks5 (Millipore, MABT336 ; 1 à 500 ) anticorps dilués dans 5 % de BSA/TBST pendant une nuit à 4 °C. Les membranes ont ensuite été incubées avec des anticorps IgG anti-souris ou anti-lapin conjugués à la HRP (Cell Signaling Technologies ; 1 à 5000) dilués dans 5 % de lait écrémé/TBST pendant 1 h à température ambiante et les protéines ont été visualisées à l'aide de réactifs de détection par chimioluminescence. (WesternBright, Advansta) et scanner de transfert (C-DiGit, LI-COR).

Pour former des tumeurs chez la souris, 200 000 cellules ont été mises en suspension dans 100 μl de collagène I à 20 % dans du PBS et injectées orthotopiquement dans le coussinet adipeux mammaire de souris femelles âgées de 7 semaines. Pour l'inoculation avec des mélanges de cellules 4T1 ou MDA-MB-231, le rapport cellulaire était de 1:1 et de 1:300 pour 4T1:67NR. Lorsque le diamètre de la tumeur a atteint 8 à 12 mm, 14 à 20 jours chez les souris Balb/cJ pour 4T1 et 67NR, 8 à 10 semaines chez les souris SCID pour MDA-MB-231, les animaux ont été sacrifiés et les tumeurs et les poumons récoltés. Pour le test clonogénique pulmonaire (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302), les poumons ont été hachés, digérés dans un cocktail de collagénase de type IV/élastase (Worthington Biochemical) et filtrés à travers une maille de 70 μm. Ensuite, la suspension cellulaire de chaque poumon a été divisée en deux plaques de culture tissulaire. Une plaque a été incubée avec une combinaison de 6-thioguanine (Cayman Chemicals) et de puromycine, pour la croissance des cellules Tks5-CTL et Tks5-KD. L'autre plaque a été incubée avec une combinaison de 6-thioguanine, puromycine et généticine pour la croissance des cellules 4T1 Tks5-KD uniquement, ou avec une combinaison de 0,5 µg/ml de puromycine et 500 µg/ml de généticine (Invitrogen) pour la croissance de MDA- MB-231 D2-KD. Après 14 jours à 37 °C et 5 % de CO2, les colonies ont été fixées dans du méthanol, colorées à l'aide de bleu de méthylène à 0,03 % (p/v) (Sigma-Aldrich) et comptées (4T1 et 67NR), ou comptées à l'aide d'un marquage fluorescent (D2 -KD).

Pour effectuer des Western blots sur les tumeurs, les tumeurs Tks5-KD ont été récoltées, hachées et digérées dans une solution de collagénase de type III (Worthington Biochemical) fraîchement préparée dans du HBSS, filtrées à travers une maille de 70 μm et cultivées pendant 7 jours dans le milieu additionné de 6- thioguanine et généticine. Les cellules ont été lysées comme décrit ci-dessus.

Pour imager les coupes tumorales, les tumeurs ont été fixées dans du PFA à 4 %, à 4 °C pendant la nuit, lavées avec du PBS glacé pendant 1 h, transférées dans une solution de saccharose à 30 % et incubées pendant la nuit à 4 °C, incorporées, congelées en OCT et coupées à 6 heures. µm d'épaisseur. Pour augmenter le signal 67NR-GFP, des tumeurs mixtes 4T1-67NR ont été marquées avec un anticorps primaire anti-GFP (ab13970, 1 à 100) et une chèvre anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor® 488, ab150169), et les noyaux ont été colorés avec DAPI .

Le logiciel RStudio a été utilisé pour effectuer toutes les analyses statistiques. La distribution de chaque ensemble de données a été analysée et le test de Shapiro-Wilk a été effectué pour tester la normalité. Pour les ensembles de données normalement distribués, un test F a été effectué pour comparer les variances de deux ensembles de données. Sur la base des résultats du test F, un test t de Welch à deux échantillons ou un test t à deux échantillons a été effectué pour comparer les moyennes des deux ensembles de données. Pour les ensembles de données non distribués normalement, un test de somme des rangs de Wilcoxon a été effectué pour comparer les deux ensembles de données. Sauf indication contraire, tous les tests ont été effectués en utilisant des critères non appariés et bilatéraux. Toutes les données sont représentées sous forme de graphiques linéaires ou de boîtes à moustaches avec médiane (ligne), 25e/75e centiles (boîtes) et maximum/minimum (moustaches). La signification statistique a été définie comme *p < 0,05, **p < 0,01 et ***p < 0,001. Des informations supplémentaires sur les métriques et les statistiques peuvent être trouvées dans le fichier de données source. Toutes les données sont disponibles sur demande.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié et ses informations supplémentaires en tant que données supplémentaires 1. Pour les légendes des données sources et des films, veuillez consulter la description des documents supplémentaires supplémentaires. Le plasmide pmScarlet-H-C1 était un cadeau de Dorus Gadella (plasmide Addgene # 85043), tandis que pEGFP-puro était un cadeau de Michael McVoy (plasmide Addgene # 45561). Des transferts Western non recadrés sont disponibles dans les figures supplémentaires. S13–S27.

Tout le code pour le traitement et l'analyse des données associé à la soumission actuelle est disponible sur https://github.com/tuzellab/cooperative_invasion et (https://doi.org/10.5281/zenodo.6639302).

Hanahan, D. & Weinberg, RA Les caractéristiques du cancer. Cellule 100, 57–70 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Vanharanta, S. & Massagué, J. Origines des traits métastatiques. Cellule cancéreuse 24, 410–421 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheung, KJ et al. Les métastases polyclonales du cancer du sein résultent de la dissémination collective de grappes de cellules tumorales exprimant la kératine 14. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 113, E854–63 (2016).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aceto, N. et al. Les amas de cellules tumorales circulantes sont des précurseurs oligoclonaux des métastases du cancer du sein. Cellule 158, 1110-1122 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tabassum, DP & Polyak, K. Tumorigénèse : il faut un village. Nat. Rév. Cancer 15, 473–483 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yeung, KT & Yang, J. Transition épithéliale-mésenchymateuse dans les métastases tumorales. Mol. Oncol. 11, 28-39 (2017).

Article PubMed Google Scholar

Ignatelli, J., Tumbarello, DA, Schmidt, RP et Turner, CE Hic-5 favorise la formation et l'invasion d'invadopodes pendant la transition épithéliale-mésenchymateuse induite par le TGF-β. J. Cell Biol. Rév. 197, 421–437 (2012).

Article CAS Google Scholar

Eckert, MA et al. La formation d'invadopodes induite par Twist1 favorise la métastase tumorale. Cellule cancéreuse 19, 372–386 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eckert, MA et al. L'induction d'ADAM12 par TWIST1 favorise l'invasion tumorale et la métastase via la régulation des invadopodes et des adhérences focales. J. Cell Sei. 130, 2036-2048 (2017).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Karamanou, K., Franchi, M., Vynios, D. & Brézillon, S. Transition épithéliale-mésenchymateuse et marqueurs d'invadopodes dans le cancer du sein : Lumican, un régulateur clé. Sémin. Cancer Biol. 62, 125-133 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Murphy, DA & Courtneidge, SA Les « tenants » et les « aboutissants » des podosomes et des invadopodes : caractéristiques, formation et fonction. Nat. Rév. Mol. Cell Biol. 12, 413–426 (2011).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eddy, RJ, Weidmann, MD, Sharma, VP & Condeelis, JS Invadopodes de cellules tumorales : protrusions invasives qui orchestrent les métastases. Tendances Cell Biol. 27, 595–607 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gligorijevic, B., Bergman, A. & Condeelis, J. La classification multiparamétrique relie les microenvironnements tumoraux au phénotype des cellules tumorales. PLoS Biol. 12, e1001995 (2014).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Gligorijevic, B. et al. La formation d'invadopodium médiée par N-WASP est impliquée dans l'intravasation et les métastases pulmonaires des tumeurs mammaires. J. Cell Sei. 125, 724–734 (2012).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ye, X. & Weinberg, RA Plasticité épithéliale-mésenchymateuse : un régulateur central de la progression du cancer. Tendances Cell Biol. 25, 675–686 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cheung, KJ, Gabrielson, E., Werb, Z. & Ewald, AJ L'invasion collective du cancer du sein nécessite un programme épithélial basal conservé. Cellule 155, 1639-1651 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, J. et al. Régulation énergétique de la dynamique coordonnée leader-suiveur lors de l'invasion collective des cellules cancéreuses du sein. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 7867–7872 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolf, K. et al. La protéolyse péricellulaire en plusieurs étapes contrôle la transition de l'invasion individuelle à l'invasion collective des cellules cancéreuses. Nat. Cell Biol. 9, 893–904 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Carey, SP, Starchenko, A., McGregor, AL et Reinhart-King, CA Les principales cellules malignes initient l'invasion collective des cellules épithéliales dans un modèle sphéroïde de tumeur hétérotypique tridimensionnel. Clin. Exp. Métastases 30, 615–630 (2013).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Westcott, JM et al. Une sous-population de cellules cancéreuses du sein épigénétiquement distincte favorise l'invasion collective. J.Clin. Enquête 125, 1927-1943 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chapman, A. et al. Des sous-populations tumorales hétérogènes coopèrent pour conduire l'invasion. Cell Rep. 8, 688–695 (2014).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bayarmagnai, B. et al. La dégradation de l'ECM médiée par les invadopodes est améliorée dans la phase G1 du cycle cellulaire. J. Cell Sei. 132, jcs227116 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miller, BE, Miller, FR, Wilburn, DJ & Heppner, GH Analyse de la composition des cellules tumorales dans les tumeurs composées de mélanges appariés de lignées cellulaires tumorales mammaires. Br. J. Cancer 56, 561–569 (1987).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dexter, DL et al. Hétérogénéité des cellules tumorales d'une seule tumeur mammaire de souris. Cancer Rés. 38, 3174-3181 (1978).

CAS PubMed Google Scholar

Aslakson, CJ & Miller, FR Événements sélectifs dans le processus métastatique défini par l'analyse de la dissémination séquentielle de sous-populations d'une tumeur mammaire de souris. Cancer Rés. 52, 1399-1405 (1992).

CAS PubMed Google Scholar

Seki, Y. et al. Effet in vitro de la cyclosporine A, de la mitomycine C et de la prednisolone sur la cinétique cellulaire dans des cellules endothéliales de veine ombilicale humaine en culture. Thromb. Rés. 115, 219–228 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Truong, HH, Xiong, J., Ghotra, V., Nirmala, E. & Haazen, L. 1 L'inhibition de l'intégrine provoque un commutateur prométastatique via le réseau TGF-miR-200-ZEB dans le sein triple négatif E-Cadherin-Positive Cancer. Sci. Signal 7, 15-15 (2014).

Article CAS Google Scholar

Ilina, O. et al. Microscopie intravitale de la plasticité d'invasion collective dans le cancer du sein. Dis. Modèle. Mech. 11, dmm034330 (2018).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Lou, Y. et al. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) n'est pas suffisante pour les métastases spontanées du cancer du sein murin. Dév. Dyn. 237, 2755–2768 (2008).

Article CAS PubMed Google Scholar

Konen, J. et al. La génomique guidée par l'image de populations phénotypiquement hétérogènes révèle la signalisation vasculaire lors de l'invasion symbiotique collective du cancer. Nat. Commun. 8, 15078 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, VP, Entenberg, D. & Condeelis, J. Imagerie de cellules vivantes à haute résolution et microscopie accélérée de la dynamique de l'invadopodium et de l'analyse de suivi. Méthodes Mol. Biol. 1046, 343–357 (2013).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Pourfarhangi, KE, Bergman, A. & Gligorijevic, B. La réticulation de l'ECM régule la dynamique des invadopodes. Biophys. J. 114, 1455-1466 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Perrin, L., Tucker, T. & Gligorijevic, B. Imagerie par fluorescence à résolution temporelle et analyse de l'invasion des cellules cancéreuses dans le modèle sphéroïde 3D. J.Vis. Exp. (2021) https://doi.org/10.3791/61902.

Smyrek, I. et al. La E-cadhérine, l'actine, les microtubules et le FAK dominent différentes phases de formation de sphéroïdes et des éléments importants de l'intégrité tissulaire. Biol. Ouvert 8, bio037051 (2019).

CAS PubMed Google Scholar

Steinberg, MS Reconstruction de tissus par des cellules dissociées. Sciences 141, 401–408 (1963).

Article CAS PubMed Google Scholar

Cerchiari, AE et al. Une stratégie d'auto-organisation tissulaire robuste à l'hétérogénéité et à la plasticité cellulaires. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 112, 2287–2292 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Labernadie, A. et al. Une adhérence hétérotypique E-cadhérine/N-cadhérine mécaniquement active permet aux fibroblastes de conduire l'invasion des cellules cancéreuses. Nat. Cell Biol. 19, 224-237 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Leong, HS et al. Les invadopodes sont nécessaires à l'extravasation des cellules cancéreuses et constituent une cible thérapeutique pour les métastases. Cell Rep. 8, 1558-1570 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Ilina, O. et al. L'adhésion cellule-cellule et le confinement de la matrice 3D déterminent les transitions de brouillage dans l'invasion du cancer du sein. Nat. Cell Biol. 22, 1103-1115 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Harney, AS et al. L'imagerie en temps réel révèle une perméabilité vasculaire locale et transitoire et une intravasation des cellules tumorales stimulées par le VEGFA dérivé des macrophages TIE2hi. Découverte du cancer. 5, 932–943 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, J. et al. Twist, maître régulateur de la morphogenèse, joue un rôle essentiel dans la métastase tumorale. Cellule 117, 927–939 (2004).

Article CAS PubMed Google Scholar

Padmanaban, V. et al. L'e-cadhérine est nécessaire pour les métastases dans plusieurs modèles de cancer du sein. Nature 573, 439–444 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aiello, NM et al. Le sous-type EMT influence la plasticité épithéliale et le mode de migration cellulaire. Dév. Cellule 45, 681–695.e4 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nieto, MA, Huang, RY-J., Jackson, RA et Thiery, JP EMT : 2016. Cellule 166, 21–45 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Tester, AM, Ruangpanit, N., Anderson, RL & Thompson, EW La sécrétion de MMP-9 et l'activation de MMP-2 distinguent les sous-lignes invasives et métastatiques d'un système de carcinome mammaire de souris présentant des traits de transition épithéliale-mésenchymateuse. Clin. Exp. Métastases 18, 553–560 (2000).

Article CAS PubMed Google Scholar

Johnstone, CN et al. Caractérisation fonctionnelle et moléculaire des tumeurs EO771.LMB, un nouveau modèle dérivé de souris C57BL/6 de cancer mammaire spontanément métastatique. Dis. Modèle. Mech. 8, 237-251 (2015).

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heisenberg, C.-P. & Bellaïche, Y. Forces dans la morphogenèse et la structuration des tissus. Cellule 153, 948–962 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Beatrici, CP & Brunnet, LG Tri cellulaire basé sur les différences de motilité. Phys. Rév. E Stat. Non lin. Physique de la matière molle. 84, 031927 (2011).

Article PubMed CAS Google Scholar

Mori, H., Gjorevski, N., Inman, JL, Bissell, MJ et Nelson, CM Auto-organisation des tubules épithéliaux modifiés par motilité cellulaire différentielle. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 106, 14890–14895 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pawlizak, S. et al. Test de l'hypothèse d'adhésion différentielle à travers la transition épithéliale-mésenchymateuse. NJ Phys. 17, 083049 (2015).

Article CAS Google Scholar

Villeneuve, C. et al. aPKCi déclenche l'extrusion basale des cellules épithéliales mammaires luminales en ajustant la contractilité et la localisation de la vinculine aux jonctions cellulaires. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 116, 24108–24114 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, W.-T., Yeh, Y. & Nakahara, H. Un test d'invasion cellulaire in vitro : Détermination de l'activité protéolytique de surface cellulaire qui dégrade la matrice extracellulaire. J. Tissue Cult. Méthodes 16, 177–181 (1994).

Article Google Scholar

Tinevez, J.-Y. et coll. TrackMate : une plate-forme ouverte et extensible pour le suivi d'une seule particule. Méthodes 115, 80–90 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Daetwyler, S., Modes, CD & Fiolka, R. Plugin Fidji pour annoter des films avec des flèches personnalisées. Biol. Ouvert 9, bio056200 (2020).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Di Martino, J. et al. Matrices 2D et 3D pour étudier la formation et l'activité linéaires des invadosomes. J.Vis. Exp. https://doi.org/10.3791/54911 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. & Berland, KM Propagateurs et coefficients de diffusion dépendant du temps pour la diffusion anormale. Biophys. J. 95, 2049-2052 (2008).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Nous tenons à remercier le noyau de cytométrie en flux de la Lewis Katz School of Medicine pour son aide dans le tri des cellules, et les membres de Temple Bioengineering et Fox Chase Cancer Center Biology pour leurs précieuses discussions. Le financement a été fourni par les NIH R00 CA172360, R01 CA230777 (BG) et R01 GM121679 (ET) ; American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM (BG) et Conquer Cancer Now/Young Investigator Award (BG).

Louisiane Perrin

Adresse actuelle : Institut Curie, UMR144, Paris, France

Département de bioingénierie, Temple University, Philadelphie, PA, États-Unis

Louisiane Perrin, Elizaveta Belova, Battuya Bayarmagnai, Erkan Tüzel & Bojana Gligorijevic

Programme de signalisation du cancer et d'épigénétique, Fox Chase Cancer Center, Philadelphie, PA, États-Unis

Bojana Gligorijevic

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Conceptualisation : LP, BG, Acquisition des données : LP, EB, BB, BG, Analyse : LP, EB, BG, ET, Supervision : BG, Rédaction : LP, EB, BB, ET, BG

Correspondance à Bojana Gligorijevic.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Jing Yang, Feng Chiao Tsai et Díaz Begoña pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la gestion principale : Ruby Huang et Eve Rogers. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Perrin, L., Belova, E., Bayarmagnai, B. et al. Les invadopodes permettent l'invasion coopérative et la métastase des cellules cancéreuses du sein. Commun Biol 5, 758 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

Télécharger la citation

Reçu : 16 juin 2021

Accepté : 28 juin 2022

Publié: 01 août 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-022-03642-z

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.