Amélioration d'une thérapie bactérienne vivante synthétique pour la phénylcétonurie avec biocapteur

Nature Communications volume 12, Numéro d'article : 6215 (2021) Citer cet article

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Chez les patients atteints de phénylcétonurie (PCU), un défaut génétique de l'enzyme phénylalanine hydroxylase (PAH) entraîne une élévation systémique de la phénylalanine (Phe), qui peut entraîner une atteinte neurologique grave. En tant que traitement de la PCU, la souche SYNB1618 d'Escherichia coli Nissle (EcN) a été développée sous la plateforme Synthetic Biotic™ de Synlogic pour dégrader la Phe depuis le tractus gastro-intestinal (GI). Cette souche modifiée au stade clinique exprime l'enzyme métabolisant Phe phénylalanine ammoniac lyase (PAL), catalysant la désamination de Phe en trans-cinnamate (TCA), un produit non toxique. Dans le présent travail, nous générons une souche PKU basée sur EcN plus puissante grâce à l'optimisation de l'activité PAL de la cellule entière, en utilisant un criblage à haut débit basé sur des biocapteurs de bibliothèques PAL mutantes. Une enzyme candidate principale de ce criblage est utilisée dans la construction de SYNB1934, une souche intégrée sur le plan chromosomique contenant les caractéristiques supplémentaires de métabolisation de Phe et de biosécurité trouvées dans SYNB1618. Face à face, SYNB1934 démontre une augmentation approximative du double de l'activité PAL in vivo par rapport à SYNB1618.

La phénylcétonurie (PCU) est une maladie métabolique caractérisée par l'absence ou la perturbation de la fonction de l'enzyme phénylalanine hydroxylase (PAH). Les patients atteints de PCU sont incapables de métaboliser l'acide aminé phénylalanine (Phe), ce qui entraîne son accumulation systémique. Des niveaux élevés de Phe peuvent entraîner de graves complications neurologiques et une invalidité s'ils ne sont pas traités. Heureusement, la PCU est diagnostiquée grâce au dépistage néonatal depuis plus de 50 ans, et si la maladie est détectée et traitée au cours des premières semaines de vie, les incapacités graves peuvent être atténuées1.

La Phe étant un acide aminé essentiel, son apport chez les patients peut être contrôlé par une restriction alimentaire en protéines ; cependant, de nombreux patients n'obtiennent pas une observance durable en raison de la nature stricte du régime. En effet, l'arrêt du régime PCU à l'âge adulte a été lié à une réduction marquée des fonctions exécutives et à un trouble dépressif majeur2,3. Outre le contrôle de l'apport en Phe par le biais d'une gestion diététique, il existe deux options de traitement pharmacologique approuvées. L'une de ces options, le dichlorhydrate de saproptérine (KUVAN, BioMarin Pharmaceutical), est un activateur de PAH pour les patients atteints de PCU sensible à la tétrathydrobioptérine (BH4). La saproptérine est un analogue de BH4 qui fournit un cofacteur supplémentaire et/ou favorise le repliement productif de l'enzyme PAH mutante. Cependant, en raison de son mécanisme, la saproptérine n'est efficace que dans le sous-ensemble de patients atteints de PCU qui ont une activité résiduelle de PAH, qui est estimée à environ un tiers de la population de PCU4,5. Même chez les patients répondant à la BH4, la saproptérine est rarement déployée en tant que thérapie unique et est destinée à être associée à une prise en charge diététique parallèle6. L'autre option de traitement, Pegvaliase (Palynziq, BioMarin Pharmaceutical), consiste en une enzyme pégylée dégradant Phe injectée par voie systémique, la phénylalanine ammoniaque lyase (PAL). Cependant, ce traitement a été associé à des rapports d'effets indésirables graves à médiation immunitaire et d'anaphylaxie7,8. Il reste un besoin d'options thérapeutiques sûres administrées par voie orale pour les patients atteints de PCU qui répondront aux besoins de l'ensemble de la population de patients, quel que soit leur âge ou leurs antécédents génétiques.

L'application de la biologie synthétique à la conception et à l'ingénierie d'organismes probiotiques capables d'exercer des fonctions thérapeutiques à partir du tractus gastro-intestinal (GI)9 suscite un intérêt considérable ces derniers temps. Nous avons précédemment rapporté la construction et la caractérisation du produit biothérapeutique vivant (LBP) SYNB1618 pour le traitement de la PKU10. Cette souche génétiquement modifiée d'Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) exprime des enzymes, dont PAL (StlA) de Photorhabdus luminescens et l-aminoacide désaminase (LAAD) de Proteus mirabilis11, destinées à dégrader la Phe alimentaire et entéro-recirculante en métabolites non toxiques dans le tractus gastro-intestinal (acide cinnamique12,13 et phénylpyruvate14, respectivement). Il a été rapporté que SYNB1618 réduisait significativement la Phe plasmatique chez les souris Pahenu2/enu2 (un modèle murin de PCU) et prévenait de manière significative un pic de Phe plasmatique chez les primates non humains (PNH) sains ayant reçu un bolus de protéines10. Le SYNB1618 a été évalué dans une première étude randomisée et contrôlée par placebo chez l'homme chez des volontaires sains et des patients atteints de PCU, où la souche s'est avérée sûre et bien tolérée, avec des augmentations dose-réponses des métabolites Phe spécifiques au SYNB1618 dans le plasma et urine15.

Au fur et à mesure que l'enthousiasme pour les PSL artificiels progresse, l'intérêt pour les méthodologies employées pour améliorer leurs performances augmentera également. Pour les organismes tels que E. coli, une multitude de pièces modulaires existent pour la construction de circuits de gènes transcriptionnels qui permettent l'expression accordable de la fonction effectrice modifiée9. L'amélioration de l'expression des gènes hétérologues dans les souches modifiées est une approche simple pour optimiser l'activité et constitue le premier goulot d'étranglement potentiel à résoudre lorsque l'on cherche à maximiser la fonction de la souche. L'amélioration de la fonction de la souche au-delà de l'expression génique repose sur l'application d'autres technologies existantes ou en évolution.

Les biocapteurs sont apparus comme une approche prometteuse pour soulager la limitation du débit dans l'ingénierie métabolique et protéique16. Lors du contrôle d'un signal rapporteur tel que la croissance ou la fluorescence, les biocapteurs permettent l'enrichissement rapide de tailles de bibliothèques qui n'étaient pas accessibles auparavant. Les taux de dépistage peuvent atteindre 107 par heure lorsque la fluorescence est utilisée comme rapporteur et que les cellules sont phénotypées sur un trieur de cellules activé par fluorescence (FACS)17. À ce jour, les efforts de criblage de biocapteurs se sont concentrés sur le déploiement de facteurs de transcription allostériques (aTF) trouvés dans la nature pour améliorer la production de métabolites aussi divers que l'antioxydant flavonoïde naringénine jusqu'au rare sucre non toxique psicose18,19,20,21,22,23 . Bien que les aTF aient été conçus avec succès pour répondre à de nouveaux métabolites24,25,26, à notre connaissance, il n'existe aucun compte rendu publié décrivant l'utilisation d'aTF modifiés pour améliorer les souches commerciales ou thérapeutiques.

Dans ce travail, nous avons d'abord conçu un aTF pour détecter et répondre à la présence de trans-cinnamate (TCA), le produit du catabolisme de Phe par PAL. En utilisant ce biocapteur comme moyen de criblage et de sélection, nous décrivons l'évolution dirigée de StlA, le PAL dans notre LBP, pour une activité cellulaire entière améliorée. Il est important de noter que le dépistage et la sélection pourraient être effectués dans EcN afin que l'amélioration de l'activité PAL soit évaluée dans le contexte d'une souche thérapeutiquement pertinente. Un variant PAL candidat a été utilisé pour construire une souche thérapeutique PKU de deuxième génération, SYNB1934, qui s'est avérée plus performante que SYNB1618 in vitro et in vivo.

Le PAL est une enzyme relativement simple qui ne dépend pas de l'oxygène, des équivalents redox ou des cofacteurs27. Cependant, dans un contexte de cellules entières, l'activité PAL peut être influencée par une multitude de facteurs physiologiques ou environnementaux, y compris l'activité métabolique bactérienne (pour faire entrer Phe ou TCA hors des cellules), le pH externe ou l'inhibition du produit final. Les travaux préliminaires ont cherché à déterminer si l'activité de la souche était limitée par l'expression de PAL, car cela offrirait une voie simple pour l'optimisation de la souche. Cependant, la production de TCA a atteint un plateau avec l'augmentation de l'expression de PAL (Fig. 1 supplémentaire). Nous avons donc concentré nos efforts sur l'optimisation des performances plutôt que sur l'expression de l'enzyme PAL elle-même en format cellule entière.

Pour permettre le criblage de bibliothèques PAL de haute complexité pour une meilleure dégradation de Phe (production de TCA), un biocapteur spécifique sensible au TCA a été conçu à l'aide de la plate-forme d'ingénierie de capteurs exclusive de Zymergen. En l'absence de TCA, l'aTF modifié réprime l'expression d'un gène (étiqueté gfp sur la figure 1a) qui code pour la protéine rapporteur fluorescente (protéine fluorescente verte, GFP); lorsque le TCA est introduit dans le système, la répression est soulagée et la gfp est exprimée (Fig. 1a). Ce système de capteur a été transformé en un plasmide à copie élevée dans un arrière-plan EcN de type sauvage et a démontré une lecture du signal GFP classée par ordre de TCA produit par une échelle de variants PAL issus des premiers efforts d'ingénierie, exprimés à partir de constructions à faible copie (Fig. 1b). À des fins de démonstration, chacune des souches de la figure 1b a été cultivée séparément dans des tubes à essai et analysée pour le signal GFP par cellule sur un cytomètre en flux à saturation. Cette approche d'échelle de souche ne prend pas en compte toute diaphonie de souche qui pourrait être observée dans une bibliothèque regroupée (par exemple, de faibles producteurs de TCA répondant au TCA dans les milieux en vrac produits par des phénotypes de production améliorés). Un enrichissement significatif d'une bibliothèque regroupée à haute complexité, qui est décrite plus en détail ci-dessous, a été obtenu à l'aide d'un flux de travail basé sur la microfluidique (Fig. 1c ; mock vs top 1 % p < 0,0001, mock-mock vs top 1 %-top 1 % p < 0,0001, et enrichissement supplémentaire des 1 % supérieurs aux 1 % supérieurs - 1 % supérieurs p < 0,0001, test d'analyse de la variance de Welch (ANOVA) avec test de comparaisons multiples T3 de Dunnett).

a Représentation schématique de l'expression du rapporteur régulée par biocapteur. En l'absence de TCA, le facteur de transcription allostérique (aTF, capteur marqué sur la figure) se lie au site opérateur de l'ADN et empêche l'expression du gène rapporteur gfp qui code pour une protéine fluorescente verte (GFP). L'activité PAL convertit la l-Phe en TCA; Le TCA se lie au capteur aTF, provoquant un changement conformationnel pour soulager la liaison à l'ADN (répression) et permettant l'expression du gène rapporteur. Symboles et abréviations : phénylalanine (l-Phe, cercles pleins jaunes), acide transcinnamique (TCA, cercles orange vides), PAL (phénylalanine ammonia lyase). b En haut : activité de la cellule entière (voir Méthodes, sur plaque) de six variants StlA PAL, normalisée par rapport à l'activité StlA de type sauvage (type sauvage replié, FOWT, les valeurs de type sauvage peuvent être trouvées dans les données sources) . n = 2 répétitions biologiques, points de données individuels affichés. En bas : histogrammes GFP par cellule des variantes du panneau supérieur après croissance jusqu'à saturation avec l'expression simultanée de la variante stlA (gène codant pour StlA), la réponse du capteur et l'expression gfp (gène codant pour la GFP). Les couleurs sont cohérentes entre les graphiques. n = 1 culture représentative par souche avec 50 000 cellules analysées. c Démonstration d'enrichissement de la bibliothèque PAL conçue. Boîtes à moustaches montrant l'activité FOWT de différentes populations de tri, accompagnées de points de données clonaux. Les cases s'étendent du premier au troisième quartile, avec une ligne médiane indiquant la médiane. Les moustaches supérieures et inférieures s'étendent jusqu'au point maximum et minimum, respectivement, à moins de 1,5 fois l'intervalle interquartile des limites de la boîte. Les points de données en dehors des moustaches sont considérés comme des valeurs aberrantes. Descriptions de tri/contrôle : type sauvage, EcN hébergeant StlA de type sauvage, n = 12 réplicats biologiques normalisés à la moyenne des 12 valeurs de production de type sauvage ; maquette, bibliothèque triée en fonction de la taille des cellules et de l'exclusion des doublets sans déclenchement basé sur GFP, n = 90 colonies indépendantes du pool trié ; top 1 %, sélection des 1 % de cellules les plus brillantes également fermées en fonction de la taille des cellules et de l'exclusion des doublets, n = 90 colonies indépendantes du pool trié ; simulation-simulation, population fictive retransformée en arrière-plan EcN frais avec capteur et simulacre triée une seconde fois sans sélection GFP, n = 90 colonies indépendantes du pool trié ; top 1%-top 1%, top 1% population retransformée en fond EcN frais avec capteur et triée pour ses 1% de cellules les plus brillantes, n = 90 colonies indépendantes du pool trié. Les valeurs P ont été calculées à l'aide du test ANOVA de Welch avec le test de comparaisons multiples T3 de Dunnett.

La diaphonie est un problème courant dans le déploiement de technologies de sélection pour isoler des phénotypes de production améliorés pour les métabolites qui diffusent ou sont transportés à travers la membrane cellulaire, y compris le TCA. En diluant les cultures et en réduisant les délais de culture pour minimiser l'accumulation de TCA dans le milieu en vrac, Flachbart et al.18 ont pu isoler des variants enzymatiques avec une activité PAL améliorée à partir d'une bibliothèque sujette aux erreurs de 2,3 × 106 membres à l'aide d'un système de capteur basé sur le activateur natif sensible au TCA HcaR de E. coli. Une autre approche pour minimiser la diffusion de petites molécules consiste à encapsuler des variants uniques de manière microfluidique dans de l'huile fluorée ou dans des billes de gel19,28,29 et à trier ensuite les gouttelettes30, mais cela a un coût de débit. Alors que la génération de gouttelettes d'eau dans l'huile peut atteindre des fréquences allant jusqu'à 10 000 gouttelettes par seconde30, les technologies de tri des gouttelettes d'eau dans l'huile atteignent généralement de manière fiable des taux de quelques dizaines à centaines de gouttelettes par seconde19,30. Cela peut être augmenté à environ un millier de gouttelettes par seconde en encapsulant les gouttelettes d'eau dans l'huile dans une seconde phase aqueuse (c'est-à-dire des gouttelettes d'eau dans l'huile dans l'eau, alias doubles émulsions) et en les triant sur un FACS28 disponible dans le commerce. , mais le processus de double émulsion est techniquement difficile et sujet à l'instabilité et à la sédimentation pendant le tri.

Dans le présent travail, nous combinons l'atténuation de la diffusion des incubations de gouttelettes avec le débit et la facilité du tri cellulaire sur un FACS dans un flux de travail que nous avons nommé pop 'n' sort (Fig. 2)31, qui est activé par le génotype- association phénotypique de notre technologie de capteurs. Étant donné que les variantes PAL ont été exprimées au sein de la même souche EcN hébergeant le système de capteur, la réponse GFP est liée à la cellule productrice elle-même plutôt qu'à la gouttelette, comme c'est le cas dans les systèmes co-cultivés de producteurs et de cellules de capteur dédiées19,29. Des enrichissements significatifs ont été obtenus lors de l'utilisation de la méthodologie de tri pop 'n' (Fig. 2b supplémentaire; mock-mock vs top 1%-top 1% p = 0,0007, test ANOVA de Welch avec test de comparaisons multiples T3 de Dunnett) par rapport au tri directement à partir de saturé culture liquide (Fig. 2a supplémentaire; p = 0, 1408).

Les cellules EcN hébergeant le plasmide du système de capteur à copie élevée (expression d'aTF modifiée, avec le gène gfp réprimé par aTF codant pour la protéine fluorescente verte GFP) et une bibliothèque de plasmides d'expression de variantes inductibles stlA à faible copie ont été cultivées ensemble dans un pool; différentes cellules de ce pool contiennent des séquences stlA uniques. Suite à une étape de pré-culture en milieu riche, les cellules sont lavées et remises en suspension dans un milieu de glucose minimal M9 adapté pour le criblage des capteurs, qui simultanément induit l'expression de stlA et fournit le substrat Phe. À ce stade, les cellules sont diluées à une DO600 qui se traduira par un chargement d'environ 1 cellule/gouttelette. Ces cellules diluées et lavées dans le milieu servent de phase aqueuse pour la génération de gouttelettes dans une huile fluorée avec un surfactant fluoré. Étant donné que le chargement des cellules suit une distribution de Poisson, certaines gouttelettes seront vides et certaines contiendront plusieurs cellules/génotypes au temps 0, comme indiqué ci-dessus. Les gouttelettes chargées sont incubées jusqu'à saturation, ~ 16 h, moment auquel il y a beaucoup de cellules par gouttelette, et ces cellules ont produit du TCA et un signal GFP par cellule qui est corrélé à cette production de TCA. Puisque le signal GFP est associé à la cellule elle-même, nous pouvons casser les émulsions en utilisant des techniques standard, puis trier les cellules directement sur un FACS pour le phénotype souhaité. Voir Méthodes pour plus de détails sur les recettes, les matériaux et les protocoles.

Dans les enrichissements de type pop 'n' décrits ici, les cellules ont été encapsulées par voie microfluidique dans des gouttelettes d'eau dans l'huile à environ 1 cellule/gouttelette. Les gouttelettes ont été incubées jusqu'à ce que les cultures encapsulées soient saturées, environ 16 h dans nos conditions de milieu et de croissance, moment auquel les émulsions ont été rompues (Méthodes). La couche aqueuse contenant les cellules a été séparée de l'huile et a pu être triée directement sur un FACS en utilisant des protocoles standards. L'approche de criblage à ultra haut débit décrite ci-dessus nous a permis de cribler une bibliothèque combinatoire de plus d'un million de membres de mutations conçues par ordinateur.

Un modèle d'homologie de StlA a été construit à l'aide de RosettaCM32 (voir Méthodes) et utilisé pour identifier les résidus de sites actifs. Pour améliorer l'activité StlA, les positions autour du site actif ont été ciblées pour la variation. Pour compenser les instabilités introduites par des mutations dans et autour du site actif, des analyses phylogénétiques (position-specific scoring matrix33 ; PSSM) et co-évolutives (GREMLIN34) ont été réalisées pour suggérer des résidus favorables (voir Méthodes). Comme le montre la figure 3a, les analyses évolutives PSSM et GREMLIN introduisent des mutations stabilisatrices largement dispersées dans StlA.

Les positions d'intérêt sont mises en évidence sur un modèle d'homologie généré pour StlA à l'aide de RosettaCM. Les résidus du site actif sont surlignés en rouge. a Positions ciblées pour la mutagenèse combinatoire lors de la construction de la bibliothèque. Toutes les positions mutées dans les modèles de bibliothèque (voir Méthodes) sont surlignées en vert, et les mutations supplémentaires ciblées pendant la mutagenèse combinatoire sont affichées en rose. b Positions mutées dans les meilleurs coups. Les positions mutées dans la variante finale SYNB1934 PAL sont surlignées en jaune, et celles mutées dans d'autres top hits (indiquées par des marqueurs spéciaux en c, plus de détails dans le supplément) sont affichées en bleu. c Un arbre phylogénétique a été généré en calculant la distance entre toutes les séquences à l'aide de la matrice de substitution Blosum6257 et en construisant l'arbre par jointure voisine dans Biopython58,59. Les couleurs indiquent le niveau d'activité normalisé au type sauvage (FOWT). Repères : carré = S92G_H133F_A433S_V470A, losange = S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, x = A93C_H133F_T322W_Y437N, étoile-carré = I28R_S92G_H133F_V470A, grand cercle = S92G_H133 F_R185E, hexagramme = S92G_F109A_H133M_T503E, type sauvage = sablier ; toutes les autres variantes uniques sont représentées par un petit cercle.

Des mutations conçues ont été introduites dans StlA de type sauvage et trois variantes améliorées de StlA (voir la Fig. 3 supplémentaire et le texte environnant pour l'origine des modèles) en utilisant une approche basée sur la PCR telle que décrite dans les méthodes. La bibliothèque de plasmides construite a été transformée en EcN contenant notre système de capteurs et préparée pour le tri cellulaire en utilisant la stratégie de tri pop 'n'. Après incubation dans des gouttelettes, les cellules ont été triées par FACS pour collecter les 1% de cellules les plus brillantes. La population résultante présentait une augmentation de la production médiane de TCA d'un sous-échantillon de 90 variants clonaux et était dépourvue de la majorité des variants à faible activité. Le deuxième tour de pop 'n' sort isolant les 1% supérieurs de la population précédente de 1% supérieure (1% supérieur-1% supérieur de la Fig. 1c) a encore enrichi la population à une médiane de> 25% d'amélioration par rapport au type sauvage avec encore moins de faux positifs. Les pools des 1% supérieurs et des 1% supérieurs des 1% supérieurs ont tous deux montré des enrichissements significatifs par rapport à leurs contrôles triés par simulation (p <0,0001, test ANOVA de Welch avec test de comparaisons multiples T3 de Dunnett).

Après l'enrichissement, environ 1500 clones ont été sélectionnés pour une évaluation sur plaque de l'activité de la cellule entière comme décrit dans les méthodes, et des variantes améliorées ont été séquencées. Six variantes PAL différentes présentaient un intérêt particulier en raison de leurs diverses séquences (Fig. 3c) et de leurs niveaux d'activité à la fois dans les essais in vitro initiaux et dans les expériences de modèle GI de simulation in vitro (IVS) (positions mises en évidence sur la Fig. 3b, séquences et activité dans le tableau supplémentaire 1). L'arbre phylogénétique de la figure 3c montre comment ces variantes divergent du type sauvage avec trois à cinq substitutions. Les six variants partagent une mutation en position 133 de l'histidine en phénylalanine ou en méthionine, ce qui augmente le tassement de l'enzyme près du site actif et est associé à une activité accrue; l'histidine de l'enzyme de type sauvage pourrait potentiellement déformer son hélice associée en interférant avec l'oxygène carbonyle de A129. Cinq des six variantes supérieures contiennent également une mutation S92G, située dans la partie C-terminale de l'hélice, qui peut servir à augmenter la flexibilité en interférant avec la liaison hydrogène de l'oxygène carbonyle. Le S92G est situé près du site actif et peut donc influencer la liaison et la libération du substrat et/ou du produit. Ces mutations sont combinées avec diverses substitutions supplémentaires en ce qui concerne la taille et la charge, comme indiqué par leurs distances dans l'arbre (Fig. 3c). D'autres spéculations sur les impacts potentiels des mutations supplémentaires peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 2.

Les cellules peuvent rencontrer diverses conditions de pH lors de leur transit dans le tractus gastro-intestinal, et il a été observé que l'activité cellulaire entière de EcN exprimant PAL de type sauvage dépend fortement du pH environnemental (Fig. 4a). Nous avons donc cherché à déterminer si les cellules exprimant des enzymes PAL évoluées affichaient un profil d'activité similaire à celui du PAL de type sauvage lorsqu'elles étaient soumises à des changements de pH. Une tendance générale à une activité globale réduite a encore été observée à un pH inférieur pour toutes les variantes testées (Fig. 4a – d supplémentaire), et l'activité a été améliorée à un pH plus alcalin (Fig. 4d supplémentaire). Malgré une réduction globale de l'activité pour toutes les variantes à pH 5, la plupart des souches ont maintenu une amélioration par rapport au type sauvage, au moins à des moments ultérieurs (Fig. 4b, Fig. 4e supplémentaire). La variante A93C_H133F_T322W_Y437N (souche ID EP2495), cependant, n'a pas bien fonctionné dans cette condition, avec un FOWT moyen <1 à 4 h (Fig. 4b) et une réduction d'activité encore plus sévère à des moments antérieurs (Fig. 4e supplémentaire), donc nous n'avons pas procédé à cette variante pour des tests supplémentaires.

a Production de cellules entières de TCA pour EcN avec StlA de type sauvage après 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h ou 4 h à pH 5, 6, 7 ou 8. n = 3 répétitions biologiques avec des points de données individuels affichés . b Activité PAL de la cellule entière après 4 h à pH 5, 6, 7 ou 8, normalisée par rapport à l'activité StlA de type sauvage (repli sur le type sauvage, FOWT). n = 3 réplicats biologiques ± sd c Activité PAL cellule entière après 4 h à pH 7, dosée sans traitement pH (témoin) ou après incubation 1 h à pH 5 (pH traité), normalisée à l'activité StlA de type sauvage (FOWT ). n = 3 réplicats biologiques ± sd Les étiquettes de l'axe X font référence aux ID de souche, EcN avec les variantes PAL. EP2315 : StlA de type sauvage, EP2516 : S92G_H133F_A433S_V470A, EP2525 : S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, EP2495 : A93C_H133F_T322W_Y437N, EP2502 : I28R_S92G_ H133F_V470A, EP2528 : S92G_H133F_R185E, EP2526 : S92G_F109A_H133M_T503E. Pour des points temporels supplémentaires et des données de production de TCA non normalisées, reportez-vous aux figures supplémentaires 4 et 5.

Pour évaluer la reprise de l'activité de la souche après un stress acide, les cellules ont d'abord été exposées à un milieu à pH 5 pendant 1 h à 37 ° C, puis testées pour l'activité à pH neutre (Fig. 4c, Fig. 5 supplémentaire). Contrairement à la très faible activité observée lors d'un dosage à pH 5 (Fig. 4a supplémentaire), les cellules ont pu récupérer après une exposition d'une heure à un milieu à pH 5 et ont démontré une activité similaire aux cellules témoins (Fig. 4c, Fig. 5a supplémentaire). ). Toutes les souches ont conservé une amélioration par rapport au contrôle StlA de type sauvage après exposition à pH 5 (Fig. 4c, Fig. 5b supplémentaire).

Deux variantes, S92G_H133F_A433S_V470A et S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, se sont particulièrement bien comportées dans ces deux tests de pH et ont démontré l'activité la plus élevée à pH neutre. Le lysat cellulaire a été préparé pour EcN hébergeant chacun de ces deux variants et le témoin PAL de type sauvage. Après normalisation de la teneur en protéines totales, les lysats des deux variantes ont démontré une augmentation significative des valeurs Vmax et KM par rapport au StlA de type sauvage (Vmax p = 0,0058 et KM p = 0,0023 pour EP2315 vs EP2516, Vmax p = 0,0135 et KM p = 0,0008 pour EP2315 vs EP2525, basé sur des tests t bilatéraux avec une variance inégale ; Tableau 1), mais il n'y avait pas de différence significative entre les deux variantes en ce qui concerne Vmax ou KM.

Bien qu'il n'y ait pas de différence perceptible entre les deux variantes principales de PAL caractérisées, la variante S92G_H133M_I167K_L432I_V470A, désormais appelée mPAL (pour mutant PAL), a été sélectionnée pour construire SYNB1934, une souche biothérapeutique vivante à base d'EcN adaptée au dosage humain9. Cette variante a été choisie plutôt que S92G_H133F_A433S_V470A car elle n'incorporait pas de Phe supplémentaire qui pourrait finalement contribuer à la charge alimentaire en Phe chez les sujets traités si les cellules étaient lysées pendant le transit. En plus des mutations S92G et H133M décrites ci-dessus, la variante comprend I167K, L432I et V470A. Pour des raisons discutées plus en détail dans le tableau supplémentaire 2, nous soupçonnons que L432I affecte la liaison/libération du substrat, alors que I167K et V470A jouent probablement un rôle dans la stabilisation de l'enzyme. Cette souche contient plusieurs copies du gène codant pour mPAL intégré dans le chromosome et, à des fins de bioconfinement, une mutation du gène dapA pour générer une auxotrophie pour le diaminopimélate, composant essentiel de la paroi cellulaire (Fig. 5a). SYNB1934 a également été conçu pour exprimer les mêmes composants auxiliaires de dégradation de Phe que SYNB1618, à savoir le transporteur Phe de haute affinité, PheP, et l'enzyme alternative de dégradation de Phe LAAD10. Comme c'est le cas pour SYNB1618, tous les gènes de résistance aux antibiotiques utilisés lors de l'ingénierie de SYNB1934 ont été supprimés à la fin de la construction de la souche.

L'activité optimisée de la souche PKU est comparée à SYNB1618. a La représentation schématique de la bactérie SYNB1934 montre des éléments clés d'ingénierie, y compris les gènes codant pour mPAL, PheP, LAAD et la suppression du gène dapA. b La production de TCA de 2,5 × 109 cellules SYNB1618 vs SYNB1934 lyophilisées remises en suspension a été mesurée dans une simulation in vitro de l'environnement intestinal. n = 3 triplicats biologiques indépendants ± les sujets sd c et d NHP ont reçu une dose orale d'un peptide de 5 g et d'un bolus d5-Phe de 0,25 g suivi d'une dose avec 1 × 1011 cellules SYNB1618 ou SYNB1934 lyophilisées remises en suspension. Les aires plasmatiques sous la courbe (AUC) pour les biomarqueurs spécifiques à la souche TCA et d5-TCA sont affichées. Pour c, n = 18 sujets PSN biologiquement indépendants par groupe ± se Pour chaque comparaison, les données ont été analysées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié (p < 0,0001). Pour la concentration urinaire de d5-HA normalisée à la créatinine (d) n = 18 pour les sujets traités au SYNB1618 et 17 pour les sujets traités au SYNB1934 ± se (un PSN du groupe traité au SYNB1934 n'a pas réussi à produire un échantillon d'urine au cours de l'expérimentation). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t bilatéral non apparié avec correction de Welch (p = 0,0184).

SYNB1934 a été cultivé et induit pour l'activité de dégradation de Phe dans un système de fermenteur entièrement contrôlé à une densité cellulaire élevée, suivi d'un lavage, d'une concentration, d'une reformulation et d'une lyophilisation. Ce procédé simule la production d'un produit médicamenteux destiné à un dosage humain. Le matériel remis en suspension à partir de SYNB1934 et de SYNB1618 lyophilisés a démontré une viabilité élevée, mesurée par un test d'exclusion de colorant fluorescent (tableau supplémentaire 3). Dans des simulations gastro-intestinales in vitro, le SYNB1934 remis en suspension a démontré une augmentation significative du taux de production de TCA d'environ deux fois par rapport au SYNB1618 (Fig. 5b; ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Tukey, p <0, 001).

Pour comparer l'activité in vivo de SYNB1934 à SYNB1618, nous sommes ensuite passés aux études sur les NHP. Nous avons déjà signalé que le plasma TCA peut être utilisé comme un biomarqueur unique spécifique à la souche pour suivre l'activité PAL des souches modifiées ; l'administration d'EcN de type sauvage n'a pas entraîné la détection de ce métabolite10. Après un bolus oral de peptides (Peptone) et de Phe deutérée (d5-Phe), les animaux ayant reçu du SYNB1934 ont démontré une augmentation significative de l'exposition plasmatique au TCA et au d5-TCA par rapport aux animaux ayant reçu du SYNB1618 (5,4 ± 1,0 vs 2,9 ± 0,9 mM*h, respectivement, pour le TCA, et 8,7 ± 2,0 contre 4,6 ± 2,0 mM*h, respectivement, pour le d5-TCA ; se ; Fig. 5c). De plus, le TCA produit par les souches in vivo est converti quantitativement par les enzymes hépatiques en acide hippurique (HA) et ciblé pour l'excrétion urinaire10,35. Contrairement au TCA plasmatique, l'HA urinaire est un métabolite commun trouvé dans l'urine des primates, ce qui entraîne des niveaux de fond significatifs10,35,36. Cependant, l'utilisation de d5-Phe par voie orale comme traceur métabolique a permis le calcul de l'excrétion urinaire de HA spécifiquement attribuable aux souches modifiées. En effet, bien qu'il existe de nombreux composés aromatiques qui peuvent être métabolisés en HA et ciblés pour l'excrétion, Phe n'en fait pas partie10, et donc la seule voie métabolique du d5-Phe oral au d5-HA urinaire passe par le d5-TCA. intermédiaire produit par PAL. Six heures après l'administration, la concentration urinaire de d5-HA chez les animaux ayant reçu du SYNB1934 était plus de deux fois supérieure à celle des animaux ayant reçu du SYNB1618 (534,4 ± 107,0 contre 249,1 ± 25,1 µg d5-HA/mg de créatinine, se ; Fig .5d).

La PCU est généralement gérée par une restriction alimentaire, qui représente un fardeau important pour les patients. Dans de nombreux cas, une mauvaise gestion alimentaire peut entraîner une mauvaise qualité de vie. Les médicaments Engineered Synthetic Biotic ™ offrent le potentiel de thérapies sûres, tolérables, réversibles et administrées par voie orale pour une variété de conditions métaboliques, y compris la PCU. EcN a été sélectionné comme châssis bactérien idéal pour le développement de souches Synthetic Biotic™. Découvert en 1917, il a été utilisé dans les populations humaines pour une variété d'affections gastro-intestinales, y compris les maladies inflammatoires de l'intestin et le syndrome du côlon irritable37,38. Il a également été rapporté que l'EcN interagissait avec l'épithélium intestinal pour stimuler les activités anti-inflammatoires et pour améliorer et maintenir la fonction de barrière39. Fait important, EcN ne présente pas de colonisation à long terme chez l'homme en bonne santé après administration orale40. La limitation du temps de séjour bactérien et la réplication in vivo sont des attributs qui permettent des propriétés pharmacologiques prévisibles et reproductibles analogues aux thérapies traditionnelles à grandes et petites molécules9. L'inclusion d'auxotrophies dans les souches modifiées agit comme des garanties pour garantir davantage des résultats prévisibles ainsi que pour limiter la croissance dans l'environnement après l'excrétion.

Ce travail s'est concentré sur l'application d'un biocapteur aTF conçu pour améliorer l'enzyme de dégradation de Phe PAL pour une souche de traitement clinique de la PCU, suivi du développement et des tests précliniques d'un biothérapeutique vivant amélioré, SYNB1934. La lecture de la fluorescence contrôlée par biocapteur permet aux chercheurs de phénotyper des millions de génotypes en une seule journée16. Cependant, la diaphonie entre les souches à haute et à faible production a historiquement présenté des difficultés pour obtenir des enrichissements efficaces pour une production améliorée18. Ici, nous présentons une méthode techniquement simple, trier pop 'n', pour atténuer la diffusion à l'aide d'émulsions eau-dans-huile pour les étapes d'incubation, tout en triant les cellules individuelles plutôt que les gouttelettes complètes par FACS. À l'aide de la méthodologie pop 'n' sort et de notre biocapteur d'ingénierie, nous avons passé au crible une bibliothèque de plus d'un million de membres pour une meilleure activité PAL des cellules entières et identifié des variantes avec une activité améliorée. Le mPAL qui a été utilisé dans la souche thérapeutique améliorée contenait cinq mutations par rapport à l'enzyme de type sauvage, dont trois sont ciblées près du site actif et nous nous attendons à jouer un rôle dans la liaison/libération du substrat et dont deux probablement avoir un effet stabilisant.

Dans des expériences de lysat cellulaire in vitro, mPAL a montré une augmentation significative de Vmax ainsi que de KM. Pour imiter l'expression et l'activité dans le LBP final aussi étroitement que possible, les étiquettes protéiques n'ont pas été incluses dans la construction des bibliothèques d'enzymes. Bien que l'analyse cinétique sur le lysat cellulaire ne permette pas de découpler le kcat de la concentration enzymatique dans les valeurs Vmax rapportées (voir tableau 1), la normalisation de la teneur totale en protéines est plus représentative de la façon dont une comparaison directe des souches thérapeutiques serait être exécuté. Il convient de noter qu'un KM plus élevé est cohérent avec une hypothèse tout au long du projet selon laquelle un faible KM (affinité de liaison plus élevée du substrat à une enzyme) peut être corrélé à une inhibition plus sévère par le produit TCA, qui est structurellement très similaire au substrat Phe. Bien que la caractérisation de l'inhibition dans StlA et mPAL de type sauvage n'ait pas été entreprise dans ce travail, la rétro-inhibition par le TCA est un trait commun dans de nombreux autres PAL caractérisés cinétiquement41,42,43,44 et est supposée pour StlA sur la base de l'activité accrue observée dans le lysat cellulaire par rapport aux cellules entières (Fig. 1 supplémentaire).

L'exposition à des pH variables sera sans aucun doute rencontrée par les souches transitant par le tractus gastro-intestinal humain. L'effet que cela peut avoir sur l'activité de déformation est un paramètre qui a récemment été modélisé mécaniquement pour SYNB161845, et les travaux futurs viseront à effectuer une modélisation similaire pour SYNB1934. Toutes les variantes de PAL identifiées dans ce travail présentaient des modèles globalement similaires d'activité de la cellule entière en réponse aux changements de pH environnemental, bien que la plupart des variantes améliorées aient encore démontré une activité accrue au-dessus de la PAL de type sauvage dans les mêmes conditions. Les enzymes PAL, en général, auraient un pH optimal dans la plage de base43,46,47,48, mais nous avons supposé que E. coli récupérerait et maintiendrait son pH cytosolique proche de la neutralité, quelle que soit la plage de pH environnemental testée au cours de ces études49. Cependant, une perméabilité accrue de la membrane et l'accumulation cytosolique d'acides organiques tels que le TCA seraient attendues à mesure que le pH diminue, ce qui pourrait entraîner une augmentation de la rétro-inhibition du PAL. Les travaux futurs viseront à élucider la cause de la réduction de l'activité PAL des cellules entières observée à faible pH, ce qui pourrait justifier le développement d'une application de capteur compatible avec le criblage à ultra-haut débit dans des conditions acides. L'incapacité du criblage entrepris dans ce travail, effectué à pH neutre, à identifier des variants avec une tolérance au pH largement améliorée est conforme à ce que l'on appelle fréquemment la première loi de l'évolution dirigée : "vous obtenez ce que vous criblez"50. Les écrans peuvent être adaptés en conséquence pour enrichir les caractéristiques d'intérêt, telles que l'activité à différents pH, températures, force osmotique, etc. Cela étant dit, il y avait quelques différences phénotypiques subtiles dans la réponse des souches variantes de plomb PAL aux changements de pH. Des variants ont été observés qui avaient une activité plus considérablement réduite que l'enzyme de type sauvage à faible pH, ou qui présentaient un taux accru de changement d'activité par rapport au type sauvage à mesure que le pH augmentait. D'autres variantes ont affiché la même amélioration d'activité par rapport à l'enzyme de type sauvage, quel que soit le pH environnemental. Ces résultats soulignent la diversité contenue dans la bibliothèque de mutants regroupés > 1 million de membres, qui, lorsqu'elle est couplée à l'écran/capteur approprié, peut être rapidement redéployée pour la sélection d'autres propriétés enzymatiques souhaitables.

Dans un essai clinique de phase 1/2a, il a été démontré que SYNB1618 consomme de la Phe et la convertit en métabolites non toxiques attendus de manière dose-réactive dans l'intestin humain de volontaires sains et de patients atteints de PCU15. Dans cette étude, SYNB1618 n'a pas été associé à une toxicité systémique et tous les sujets ont éliminé la bactérie quelques jours après la dernière dose. Bien qu'ils ne soient pas capables de détecter un changement dans la Phe plasmatique en raison de la petite taille de la cohorte de patients atteints de PCU, les résultats ont soutenu la poursuite de l'étude du SYNB1618 dans l'essai clinique de phase 2 comprenant une plus grande cohorte de patients atteints de PCU (SynPheny-1 ; NCT04534842). En parallèle, SYNB1934 a été construit et testé en préclinique, où nous avons montré qu'il surpasse SYNB1618 in vitro et in vivo. Une étude de phase 1 de SYNB1934 a récemment été lancée (NCT04984525). Par rapport au SYNB1618, le SYNB1934 peut offrir une réduction améliorée de la Phe plasmatique, le potentiel d'une posologie plus faible ou d'autres avantages thérapeutiques.

Pour le criblage des biocapteurs et la caractérisation des variants PAL, le gène codant pour StlA de Photorhabdus luminescens11 et les variants StlA ont été exprimés à partir de plasmides inductibles par l'anhydrotétracycline (aTc) contenant des origines de réplication à faible nombre de copies (pSC101). Ces plasmides codent pour un TetR autorégulé et une cassette constitutive de résistance à la spectinomycine ; 100 µg/mL de spectinomycine ont été fournis à toutes les étapes de croissance pour la maintenance du plasmide StlA. Des approches de conception et de construction de bibliothèques variantes sont décrites ci-dessous. Le système de capteurs (biocapteur TCA d'ingénierie et expression de gfp régulée par biocapteur) était contenu sur un seul plasmide à copie élevée avec un marqueur constitutif de résistance à l'ampicilline; 100 µg/mL de carbénicilline ont été fournis à toutes les étapes de croissance pour la maintenance du plasmide du capteur.

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) a été acheté auprès de la Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires (DSMZ Braunschweig, E. coli DSM 6601). Des souches candidates cliniques dégradant Phe ont été construites par l'insertion de gènes dans le chromosome EcN. La construction de SYNB1618 a été décrite précédemment10. Les loci intergéniques, malEK, araBC, yicS/nepI, agaI/rsmI, exo/cea et rhtBC ont tous été identifiés comme des sites d'insertion appropriés. Ces régions intergéniques sont constituées de promoteurs divergents ou de cadres de lecture ouverts convergents séparés par une longueur significative d'ADN de telle sorte que toute séquence insérée ne devrait pas conduire à des effets polaires sur les gènes ou promoteurs voisins. Les insertions chromosomiques dans le génome EcN ont été réalisées à l'aide de l'approche bien caractérisée de recombinaison lambda Red51. Pour chaque insertion, (1) un plasmide à base de pKD3 ou pKD4 contenant 1000 bp d'homologie du génome EcN 5 'et 3' pour la recombinaison a été construit, suivi de (2) l'insertion du gène/promoteur d'intérêt dans le plasmide par l'isotherme assemblage (HiFI DNA Assembly Master Mix, NEB), (3) amplification du fragment d'insertion du plasmide par PCR (y compris les régions d'homologie EcN et un site cible de reconnaissance de flippase (frt) flanqué d'une cassette de résistance au chloramphénicol ou à la kanamycine pour l'élimination ultérieure de la cassette antibiotique, Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB), (4) la recombinaison du fragment d'insertion par électroporation via pKD46 et l'élimination ultérieure de pKD46, et (5) l'élimination des cassettes de résistance aux antibiotiques via pCP20 et l'élimination ultérieure de pCP20. Toutes les séquences d'ADN pour les insertions génomiques utilisées dans la construction de SYNB1618 et SYNB1934 sont disponibles sur demande.

Pour la délétion du gène dapA, deux séries de PCR ont été réalisées en utilisant des amorces imbriquées. Pour le premier cycle de PCR, pKD3 a été utilisé comme ADN matrice. Les amorces ont été conçues pour générer un fragment d'ADNdb contenant une homologie adjacente au locus du gène dapA dans le chromosome EcN et un gène de résistance au chloramphénicol flanqué de sites frt. Les amorces utilisées dans le deuxième tour de PCR utilisaient le produit de PCR du premier tour comme ADN matrice. EcN contenant pKD46 a été transformé avec le fragment knock-out dapA par électroporation. Les colonies ont été sélectionnées sur gélose LB contenant du chloramphénicol (30 µg/ml) et du diaminopimélate (Sigma, D1377 ; 100 µg/ml).

Toute l'électroporation a été réalisée dans un Eppendorf Eporator (impulsion de 1,8 kV, électrocuvettes de 1 mm de longueur d'espace). Les cellules transformées ont été sélectionnées sous forme de colonies sur gélose LB (Sigma, L2897) contenant de la carbénicilline à 100 μg/ml de kanamycine à 50 μg/ml le cas échéant.

La phénylalanine a été obtenue auprès de VWR (numéro de catalogue 97062-556) ou de Sigma (numéro de catalogue P2126), et les sels M9 ont été achetés auprès de Fisher (numéro de catalogue DF0485-17). La biomasse activée a été dosée pour l'activité de la cellule entière dans M9 (6,8 g/L Na2HPO4 + 3 g/L KH2PO4 + 0,5 g/L NaCl + 1 g/L NH4Cl) + 0,5 % de glucose + 40 mM de phénylalanine. Une recette de glucose minimale M9 adaptée avec une concentration réduite en phénylalanine a été utilisée pour les dépistages à base de capteurs : 1 % de glucose + 13,6 g/L de Na2HPO4 + 6 g/L de KH2PO4 + 1 g/L de NaCl + 2 g/L de NH4Cl + 1 % de LB Lennox + traces de métaux (0,0002 % C6H8FeNO7, 1,8 mg/L ZnSO4·7 H2O, 1,8 mg/L CuSO4·5 H2O, 1,2 mg/L MnSO4·H2O, 1,8 mg/L CoCl2·6 H2O) + antibiotique pour l'entretien du plasmide + 200 ng/mL aTc pour l'expression du variant stlA + L-phénylalanine 10 mM comme substrat.

Un biocapteur spécifique d'aTF sensible au TCA a été conçu à l'aide de la plate-forme de développement de capteurs exclusive de Zymergen. Il a été enrichi à partir d'une bibliothèque de capteurs conçus en sélectionnant une GFP élevée par cellule en présence de TCA et une faible GFP de fond par cellule en l'absence de TCA sur un FACS. Les meilleurs candidats biocapteurs ont été caractérisés en outre pour leur spécificité pour le TCA par rapport aux ligands apparentés dans l'EcN de l'hôte de production, ainsi que pour leurs corrélations avec le TCA produit à l'aide de variants StlA de niveaux d'activité connus (Fig. 1b).

Un modèle d'homologie de StlA a été construit en utilisant RosettaCM32. Les modèles ont été identifiés en utilisant HHblits et HHsearch52 en recherchant dans les bases de données Pfam et PDB70. Les 10 modèles PDB les mieux notés ont ensuite été utilisés par RosettaScripts53 avec la fonction d'énergie bêta54 pour construire un ensemble de structures d'homologie ; 200 leurres ont été générés et l'énergie la plus faible a été sélectionnée. Le code utilisé dans cette analyse, ainsi que les instructions, se trouvent dans le référentiel GitHub suivant : https://github.com/Zymergen/AdolfsenIsabella_NatComm.

Pour concevoir des bibliothèques pour les enzymes cibles, nous avons utilisé trois approches : l'analyse phylogénétique, l'analyse co-évolutive et l'analyse structurale.

Pour effectuer l'analyse phylogénétique, un PSSM a été généré à l'aide de PSI-BLAST33 (généralement en utilisant les paramètres par défaut de la valeur e = 0,01 et des itérations = 3) et utilisé pour évaluer les substitutions uniques de la séquence StlA de type sauvage. La matrice résultante contient un score pour chaque acide aminé possible à chaque position dans la protéine, correspondant à la fréquence de l'acide aminé à cette position dans l'ensemble des séquences homologues renvoyées par PSI-BLAST. Ces substitutions potentielles ont été comparées au score du résidu de type sauvage à cette position et, si des substitutions à score significativement plus élevé (seuil typique : score z> 2) étaient disponibles dans le PSSM, l'acide aminé à cette position donnée a été sélectionné pour vérification expérimentale.

Pour étendre l'analyse afin d'inclure les couplages de résidus, une analyse de coévolution a été effectuée pour StlA à l'aide de GREMLIN34, et tous les couplages ont été analysés et optimisés. Pour les positions où le couplage n'était pas optimal selon l'analyse, la substitution d'acides aminés la plus optimale a été sélectionnée pour être testée expérimentalement.

Enfin, pour cibler le site actif, des positions à proximité du site actif ont été identifiées à l'aide du modèle d'homologie (génération de modèle décrite dans la section précédente). Si ces positions avaient été observées dans l'analyse phylogénétique (score PSSM> 0), elles ont été incluses dans la bibliothèque pour validation expérimentale.

La bibliothèque a été intégrée à quatre modèles : StlA de type sauvage et trois variantes qui avaient démontré des performances améliorées dans les premiers efforts d'ingénierie (H133M_I167K_V207I, S92G_H133F_Y437N et A93C_H133M_I167K, qui présentaient tous une amélioration de 20 à 40 % de l'activité par rapport à StlA de type sauvage). Les modèles de variants StlA, chacun hébergé dans un squelette de plasmide inductible par aTc à faible nombre de copies, ont été mélangés dans un rapport équimolaire pour fournir le modèle de plasmide pour une approche de construction de bibliothèque à base d'oligo. Une paire d'amorces distincte (données supplémentaires) a été conçue pour introduire chacune des mutations cibles par le biais d'une réaction du Golden Gate en une seule pièce, en utilisant la PCR55 inverse pour amplifier le plasmide entier au site de mutation cible. Pour les 130 mutations cibles, 130 PCR distinctes (Q5 High-Fidelity Master Mix, NEB) ont été réalisées. Un sous-échantillon de chaque réaction a été exécuté sur un gel d'agarose pour permettre la quantification de l'intensité relative de la bande, qui a été utilisée pour normaliser et regrouper les 130 produits de PCR. Les produits regroupés ont été digérés par DpnI et purifiés sur gel, puis circularisés à l'aide du mélange NEB Golden Gate (BsaI-v2) à 37 ° C pendant 1 h, suivi d'une inactivation à la chaleur à 60 ° C pendant 5 min. La bibliothèque circularisée regroupée de 130 mutations × 4 modèles a été transformée en cellules électrocompétentes NEB10β en utilisant le protocole de NEB. Les cultures récupérées ont été transférées dans LB avec des antibiotiques pour une sélection nocturne des transformants, et un sous-échantillon a été étalé sur des plaques de gélose LB avec des antibiotiques pour confirmer une couverture adéquate de la bibliothèque. Ce processus a été répété deux fois de plus, générant des bibliothèques combinatoires d'une et deux combinaisons de mutations conçues après un deuxième cycle, et une, deux et trois combinaisons de mutations conçues après un troisième. Pour les deuxième et troisième cycles de clonage, le plasmide de la bibliothèque a été purifié à partir de la culture de sélection pendant la nuit et utilisé comme matrice dans le cycle suivant de mutagenèse PCR. Après trois cycles de clonage, la bibliothèque à faible nombre de copies inductible par aTc > 1 million de membres a été transformée en une souche hôte E. coli Nissle (EcN) de type sauvage contenant le système de capteur sur un plasmide à copie élevée.

Pour réduire la diaphonie pendant la production de TCA et la réponse du capteur, les cellules ont été encapsulées dans des gouttelettes d'eau dans l'huile générées par microfluidique. Les bibliothèques ont été inoculées dans 10 ml d'antibiotique LB+ (voir « Plasmides » ci-dessus) dans des tubes à essai de 25 mm à partir d'un volume suffisant de stock de stockage de glycérol à -80 °C pour maintenir la complexité de la bibliothèque. Les cultures ont été incubées pendant une nuit d'environ 16 h jusqu'à saturation, moment auquel 1 ml de la culture a été centrifugé à 17 800 × g pendant 1 min et le culot remis en suspension dans un volume égal de milieu de réponse du capteur filtré (voir "Médias de dosage" ci-dessus). La DO600 des cellules lavées a été mesurée sur un spectrophotomètre Genesys 20 avec une dilution 20x, et les cellules ont été diluées à une DO600 de 0,03 dans le même milieu. Une DO600 de 0,03 entraîne l'encapsulation d'environ une cellule par gouttelette de 40 µm en moyenne au temps 0.

Des gouttelettes ont été générées dans de l'huile Sphere Fluidics (Pico-SurfTM 1, 2% dans NovecTM 7500, Lot # 031117-1 - dilué à 1% de tensioactif dans NovecTM 7500 supplémentaire) à un taux d'environ 3,4 kHz dans un dispositif microfluidique à focalisation de flux, fabriqués en interne sous forme de puces PDMS sur verre. Les gouttelettes ont été recueillies dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml et incubées à 33 ° C dans un incubateur debout sans culbutage pendant environ 16 h. Après l'incubation, les émulsions ont été brisées en ajoutant un volume suffisant de 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoro-1-octanol (Sigma), en vortexant pendant ~ 15 s et en tournant par impulsions ~ 1 s dans une centrifugeuse ministre VWR Galaxy pour séparer le couches organiques et aqueuses. La couche aqueuse contient les cellules qui ont été libérées des gouttelettes. La phase aqueuse des émulsions brisées a été diluée 100 fois dans une solution saline tamponnée au phosphate filtrée (PBS) avant le tri cellulaire.

Les cellules ont été triées sur un trieur de cellules Bio-Rad S3E à un taux d'événements cible de 1500 événements/s avec les chambres d'échantillon et de collecte maintenues à température ambiante à l'aide de la version 1.6.0.12 du logiciel ProSortTM. Les événements ont été recueillis dans des tubes à capuchon en polypropylène de 5 ml (Falcon) contenant un volume initial de 0,5 ml de LB. Les événements ont été contrôlés à l'aide de trois métriques : une porte elliptique SSC-Area vs FSC-Area pour isoler les cellules EcN de taille similaire, une porte FSC-Height vs FSC-Area pour exclure tout doublet et une GFP-Area (FITC-A) porte pour sélectionner les cellules en fonction de la forte réponse du capteur. Cette stratégie de déclenchement est illustrée dans la Fig. 6 supplémentaire. Le volume trié a été dilué dans suffisamment de LB Lennox + antibiotique pour une récupération pendant la nuit à 33 ° C à 220 tr/min. Pour éviter les inquiétudes concernant la dérive génétique de multiples excroissances, les plasmides StlA des populations récupérées ont été purifiés et transformés en EcN frais contenant le plasmide capteur avant d'effectuer les tris suivants.

150 µL de LB Lennox + antibiotique dans des plaques standard à 96 puits (numéro de catalogue VWR 82050-772) ont été inoculés à partir de colonies d'E. coli Nissle contenant des plasmides d'expression variants StlA et un plasmide capteur. Ces plaques de pré-culture ont été incubées pendant une nuit à 33 ° C à 750 tr / min dans un incubateur Incu-Mixer MP (Benchmark Scientific), recouvert d'un film poreux VWR (numéro de catalogue VWR 60941-086).

Les précultures d'une nuit ont été inoculées à 1:100 dans 1 ml de LB Lennox + antibiotique dans des plaques à puits profonds à 96 puits (numéro de catalogue VWR 89047-264). Les plaques ont été recouvertes d'un film poreux VWR et incubées dans un Incu-Mixer à 33 ° C 1500 tr / min pendant 2 h en phase exponentielle. Après 2 h, tous les puits ont été induits avec 200 ng/mL d'aTc (concentration finale, numéro de catalogue VWR 200002-828) et replacés dans l'Incu-Mixer pendant 4 h à 33 °C 1500 tr/min, à nouveau recouverts d'un film poreux VWR. Toutes les étapes restantes ont été réalisées à 4 °C/sur glace. Après 4 h, les plaques ont été centrifugées à 3214 × g pendant 10 min. Le surnageant a été décanté et les culots ont été lavés dans 250 µL de PBS froid. La plaque a été à nouveau centrifugée à 3214 × g pendant 10 min et décantée. Les culots ont été remis en suspension dans 30 µL de PBS froid (~ 40 µL final avec culot cellulaire). A cela, 40 µL de glycérol froid à 50 % ont été ajoutés, conduisant à une préparation OD600~25. Les préparations cellulaires ont été transférées dans des plaques PCR à 96 puits réfrigérées, recouvertes de papier d'aluminium et stockées à -80 ° C jusqu'au test.

Pour le test, des aliquotes de plaque PCR à 96 puits de préparation de biomasse activée ont été décongelées à 4 ° C, et 4 µL de chaque OD600 = 25 biomasse activée ont été aliquotés sur une plaque PCR à 96 puits et stockés sur de la glace jusqu'au début du test. Pour lancer le test, 96 µL de tampon de test préchauffé (37 °C) (M9 0,5 % glucose 40 mM phénylalanine) ont été ajoutés à la biomasse activée de 4 µL, mélangés, recouverts de papier d'aluminium et placés dans la cuve statique à 37 °C. incubateur. Après 4 h, les cellules ont été culottées par centrifugation à 3214 × g 4 °C pendant 10 min. Après granulation, le TCA a été quantifié à partir des surnageants dans un lecteur de microplaques Synergy H1 à une absorbance de 290 nm dans des microplaques UV-Star (numéro de catalogue Greiner 655801) après dilution dans l'eau dans la plage linéaire de l'instrument. Le volume final dans la plaque était de 150 µL. Une courbe standard a été utilisée pour traduire les mesures A290 en TCA (mM) en utilisant de l'acide trans-cinnamique acheté auprès de Sigma (numéro de catalogue C80857). Les concentrations de TCA produites à partir de variantes sélectionnées ont été confirmées par chromatographie liquide à haute performance. Pour les normalisations repliées de type sauvage (FOWT), les niveaux de TCA variants ont été divisés par les valeurs moyennes de TCA de type sauvage provenant du même test.

Au cours d'une caractérisation plus poussée des variantes PAL supérieures, la biomasse activée a été normalisée plus méticuleusement à OD600 = 1 pendant les tests d'activité. Des tubes de culture avec 10 ml de LB Lennox + antibiotique ont été inoculés à 1:100 à partir de 3 ml de LB Lennox + antibiotique 33 ° C 220 tr/min de pré-cultures pendant la nuit. Ceux-ci ont été incubés pendant 2 h à 33 °C 220 tr/min, moment auquel ils ont été induits avec 200 ng/mL d'aTc et replacés dans l'incubateur à 33 °C 220 tr/min. Toutes les étapes de préparation restantes ont été effectuées sur de la glace/à 4 °C. Après 4 h d'induction, les cultures ont été transférées dans des tubes coniques de 15 mL (Falcon) et centrifugées à 3214 × g pendant 10 min, remises en suspension dans 1 mL de PBS froid et transférées dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL. Ils ont ensuite été lavés une fois de plus dans 1 ml de PBS froid (17 800 × g 1 min dans une microcentrifugeuse) et remis en suspension une dernière fois dans 300 µl de PBS. Les mesures de DO600 ont été effectuées dans des cuvettes et les cellules ont été normalisées à DO600 = 50 dans 300 µL de PBS froid. Aux 300 µL OD600 = 50 dans des échantillons de PBS, 300 µL de glycérol froid à 50 % ont été ajoutés pour une DO600 finale = 25. Des aliquotes ont été distribuées dans des tubes PCR pour chaque souche et stockées à -80 °C jusqu'à ce que le dosage de la biomasse activée puisse être effectué. .

Pour les dosages effectués à différents pH (Fig. 4b), la biomasse activée a été décongelée à 4 ° C et diluée à OD600 = 1 dans M9 0,5% glucose 40 mM Phe titré à pH 5, 6, 7 ou 8 dans 96 puits Plaques PCR. La plaque a été recouverte de papier d'aluminium et incubée à 37°C pendant 4 h. Les plaques PCR ont ensuite été centrifugées à 3214 × g 4 ° C pendant 10 min et les surnageants ont été quantifiés par absorbance à 290 nm comme décrit dans "Test de biomasse activée à base de plaques pour la production de TCA à partir de souches" ci-dessus.

Pour les essais effectués après récupération à partir d'un pH bas (Fig. 4c), les aliquotes de biomasse activée ont été décongelées et diluées à OD600 = 1 dans du glucose M9 à 0, 5% à pH 5 (sans Phe) dans des plaques PCR à 96 puits. Les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 1 h sans agitation, centrifugées à 3214 × g 4 ° C pendant 10 min et lavées dans du PBS, puis ont été testées pour l'activité de la biomasse activée à pH neutre comme décrit dans "Plate-based Activated Biomasse dosage de la production de TCA à partir des souches" ci-dessus. Pour contrôler la perte de cellules pendant les étapes de lavage pour éliminer le milieu à pH 5, de la biomasse fraîche activée a été ajoutée à des plaques PCR à 96 puits, lavée avec les échantillons incubés à pH 5, puis dosée pour l'activité de la biomasse activée ; ces échantillons sont étiquetés "témoin" sur la figure 4c. Pour les normalisations FOWT, les niveaux de TCA variants ont été divisés par les valeurs moyennes de TCA de type sauvage du même test.

Une série de souches exprimant PAL ont été construites dans EcN, qui comprenait des souches (2) avec une seule insertion chromosomique de stlA à des endroits séparés, une souche contenant les deux copies du gène stlA chromosomique dans le même arrière-plan, une souche avec un stlA à faible copie - exprimant le plasmide (origine pSC101) et une souche avec un plasmide exprimant stlA à copie élevée (origine pUC). Dans chacune de ces souches, la même séquence codante stlA, le même site de liaison au ribosome et le même promoteur inductible par aTc ont été utilisés de sorte que la seule différence entre les souches était l'emplacement de l'insertion chromosomique et/ou le nombre de copies du gène stlA. Pour la croissance de la souche et l'induction PAL, des flacons à chicanes de 50 ml contenant 10 ml de bouillon LB Lennox contenant les antibiotiques appropriés ont été inoculés à 1:100 à partir de cultures d'une nuit. Les flacons ont été cultivés en secouant à 37 ° C 250 tr/min dans un agitateur orbital Eppendorf pendant 2 h pour amener les cultures en phase exponentielle, moment auquel aTc a été ajouté à 200 ng/mL aTc (concentration finale, numéro de catalogue VWR 200002-828). Les cellules ont été laissées se développer induites pendant 4 h supplémentaires avant centrifugation pendant 10 min à 5000 × g et remise en suspension des culots dans un volume égal de PBS glacé.

Pour mesurer l'activité PAL des cellules entières, les souches ont été remises en suspension à une DO600 de 0,1 dans 1 mL de tampon de dosage Phe (M9 0,5 % de glucose contenant 40 mM Phe) dans des tubes de microcentrifugeuse et placées dans un bloc chauffant à 37 °C. Les échantillons ont été prélevés toutes les 30 min pendant 2 h et la concentration de TCA a été déterminée par la mesure OD290 comme décrit ci-dessus. Les taux de production de TCA ont été extrapolés à partir de la concentration de TCA mesurée dans le surnageant au fil du temps.

Pour mesurer l'activité PAL des lysats, un volume de 6 ml de cellules remises en suspension a été passé à travers un homogénéisateur Microfluidics™ LV1 Low volume Microfludizer® à une pression de 18 000 psi. Chaque souche a été passée trois fois dans l'homogénéisateur pour assurer une lyse complète. Les lysats résultants ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 20 min pour sédimenter le matériau insoluble. La concentration de protéines solubles totales pour chaque lysat clarifié a été déterminée via un test BCA (Pierce, numéro de catalogue 23227). Les taux de production de TCA ont été déterminés de manière similaire à la méthode utilisée pour les cellules entières décrites ci-dessus, à l'exception que 30 mg de protéine soluble ont été utilisés pour fournir PAL pour le dosage plutôt que la remise en suspension des cellules.

Des gels d'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium – polyacrylamide (SDS – PAGE) ont été exécutés en utilisant des cellules entières de WT EcN et la série de souches modifiées décrites ci-dessus. Les cellules ont été cultivées et induites comme décrit. Des cellules entières de chaque souche induite ont été remises en suspension à une DO600 de 0, 5 et bouillies dans un tampon de chargement d'échantillon de dodécyl sulfate de lithium 1 × pendant 15 min (Invitrogen, numéro de catalogue NP0007). Un volume de 20 μL de chaque échantillon a été chargé sur un gel SDS-PAGE d'empilement bis-tris 4–12% (Invitrogen, numéro de catalogue NP0322). Pour les normes, iBright Prestained Protein Ladder (Invitrogen, numéro de catalogue LC5615) a été inclus pour estimer la taille des protéines. Les gels ont été exécutés dans un tampon MES SDS (Invitrogen, numéro de catalogue NP0002) à 200 V pendant 30 min et colorés avec SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, numéro de catalogue LC6065) conformément aux instructions du fabricant.

La biomasse activée a été préparée à partir de tubes de culture de 10 ml comme décrit dans la section ci-dessus, puis lysée pour la détermination des paramètres cinétiques. Pour préparer le lysat, des échantillons de biomasse décongelés ont été dilués et soniqués à l'aide d'un Branson Digital Sonifier avec micropointe, puis la fraction soluble des échantillons de lysat a été utilisée pour le dosage cinétique. La protéine totale dans les échantillons de lysat a été mesurée via le test Bradford, et tous les échantillons ont été normalisés à une charge de protéine totale de 10 µg par puits pour le test cinétique. Les échantillons de lysat ont été incubés dans du glucose M9 à 0, 5% avec des concentrations de Phe allant de 40 mM de Phe à 39 μM avec des dilutions doubles (un tampon d'essai sans Phe a également été inclus comme contrôle). Le test cinétique a été réalisé dans des microplaques UV-star à 96 puits (Greiner) avec du TCA quantifié par des mesures A290 toutes les minutes à l'aide d'un lecteur de microplaques BioTek Synergy H1 réglé sur une incubation statique à 37 ° C. L'ajustement du modèle de Michaelis – Menten a été effectué à l'aide d'une régression non linéaire (fonction nls dans R avec la formule V = (Vmax * [S])/(KM + [S])) pour les données de taux de trois répétitions de lots. Des exemples d'ajustements de modèle peuvent être trouvés dans la Fig. 7 supplémentaire. Le taux V utilisé dans la régression non linéaire a été calculé à partir de la première heure d'activité pour chaque concentration de Phe testée, où l'activité est restée linéaire.

Toutes les souches ont été cultivées dans des milieux de fermentation, qui ont été préparés comme suit : extrait de levure (40 g/L), K2HPO4 (5 g/L), KH2PO4 (3,5 g/L), (NH4)2HPO4 (3,5 g/L), MgSO4*7H2O (0,5 g/L), FeCl3 (1,6 mg/L), CoCl2*6H2O (0,2 mg/mL), CuCl2 (0,1 mg/L), ZnCl2 (0,2 mg/L), NaMoO4 (0,2 mg/L ), H3BO3 (0,05 mg/L), Glycérol (25 g/L), Antimousse 204 (125 μL/L). La production de souches a commencé en décongelant un flacon d'une banque de cellules et en cultivant 1 mL du flacon décongelé dans 50 mL de milieu de fermentation additionné de diaminopimélate (300 µg/mL) dans un flacon Ultra-Yield™ de 500 mL (Thomson Instrument Company). Les cellules ont été cultivées sous agitation à 375 tr/min jusqu'à ce qu'une DO600 de 10-15 soit atteinte, moment auquel les cultures ont été utilisées pour inoculer 24,5 L de milieu dans un fermenteur à usage unique HyPerforma™ Thermo Scientific 30 L à une DO600 de départ de 0,000016. Le fermenteur a été contrôlé à 37 ° C, 60% de concentration en oxygène dissous (DO) et pH 7 en utilisant de l'hydroxyde d'ammonium. Pour SYNB1618, à une DO600 de 1,5, les cellules ont été activées par la création d'un environnement à faible teneur en oxygène (10% DO) et l'ajout d'isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG, 1 mM). Une alimentation nutritive a également commencé à ce moment (15 mL/Lh de 271,75 g/L d'extrait de levure, 86,27 g/L de glycérol) et s'est poursuivie jusqu'à la fin de la fermentation. Après 3,5 h à partir de l'ajout d'IPTG, le débit d'alimentation en nutriments a été doublé à 30 mL/Lh. Pour SYNB1934, à une DO600 d'environ 1,5, les cellules ont été activées par l'ajout d'IPTG (1 mM) et la DO a été maintenue à 30 %. Une alimentation nutritive a également commencé à ce moment (11,25 mL/Lh d'extrait de levure à 271,75 g/L, 86,27 g/L de glucose) et s'est poursuivie pendant 3,5 h. Après 3,5 h, le débit d'alimentation en nutriments a été doublé à 22,5 mL/Lh pendant une période de 2,75 h. Pour les deux souches, du l-arabinose a été ajouté à la fermentation (concentration finale 10 mM) pendant la dernière heure de fermentation. La souche témoin SYN094, qui ne contient aucun composant de dégradation du Phe, a été cultivée dans un bioréacteur de 5 L dans un milieu de fermentation fournissant une teneur constante en OD de 30 % jusqu'à ce que la phase stationnaire soit atteinte. Les souches ont été récoltées par filtration tangentielle (TFF).

À la fin du TFF, le surnageant a été jeté et les cellules ont été remises en suspension à une concentration finale de 150 OD600 dans un tampon lyoprotecteur (10 % poids/volume de tréhalose, Tris 50 mM, pH 7,5). La suspension cellulaire formulée a été utilisée pour remplir des flacons en verre ambré de 2 ml et lyophilisée jusqu'à une teneur finale en eau < 5 %. Le matériel lyophilisé a été stocké à 4 °C. La poudre lyophilisée séchée a été reconstituée avec du PBS (Quality Biological, 114-056-101) pour correspondre au volume de pré-lyophilisation. Cette suspension cellulaire reconstituée a été utilisée pour mesurer l'activité, la viabilité.

Pour déterminer la viabilité des cellules bactériennes, les cellules remises en suspension ont été diluées et colorées avec le colorant d'acide nucléique SYTOX Green (Life Technologies). Les cellules colorées vivantes et mortes ont été comptées directement sur un cytomètre d'image Nexcelom Bioscience Cellometer X2 selon le protocole du fabricant.

Le modèle de simulation gastrique in vitro a été conçu pour simuler les principaux aspects de l'administration orale chez l'homme, notamment la concentration d'oxygène gastrique, la sécrétion de pepsine et le pH gastrique. Le test IVS comprend des incubations dans un format de plaque de microtitration à 96 puits conçu pour simuler les conditions de l'estomac humain56. En bref, les cellules lyophilisées ont été remises en suspension dans du PBS à température ambiante. Les concentrations de cellules bactériennes ont été déterminées par comptage des cellules viables et/ou totales. Des aliquotes de cellules ont été remises en suspension dans un tampon de bicarbonate de sodium 0,077 M à 5,0 × 109 cellules par ml. Cette solution a ensuite été mélangée à des parties égales de liquide gastrique simulé contenant 20 mM de Phe et incubée pendant 2 h à 37 ° C sous agitation dans une chambre hypoxique in vitro en polycarbonate (Coy Lab Products) calibrée à 2% d'oxygène. La densité de cellules SYNB1618 résultante dans SGF était de 2,5 × 109 cellules/mL. Pour déterminer l'activité PAL, des aliquotes de SGF ont été prélevées périodiquement et centrifugées à 5000 × g pendant 5 minutes à l'aide d'une centrifugeuse de table, suivies d'une quantification des métabolites par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS), y compris Phe et trans-cinnamate ( PBS).

Des études sur les PSN ont été réalisées à Charles River Labs (Shrewsbury, MA) conformément à toutes les sections applicables des règlements de la loi sur la protection des animaux (Code of Federal Regulations, Title 9), de la politique des services de santé publique sur les soins humains et l'utilisation de Laboratory Animals du Bureau du bien-être des animaux de laboratoire et le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du National Research Council. Douze singes cynomolgus mâles âgés de 2 à 5 ans ont été utilisés (2,5 à 4 kg) et ont été maintenus sous International Certified Primate Chow (PMI nutrition, 5048). Les procédures opérationnelles normalisées liées aux études sur les PSN ont été examinées et approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux des laboratoires Charles River. Tous les animaux de la cohorte étaient en bonne santé au début de l'étude et lavés pendant au moins 7 jours entre les études. Trois études à dose unique ont été réalisées pour comparer le SYNB1934 au SYN1618. Lors de chacun des jours expérimentaux, six sujets PSN ont reçu une dose de SYNB1618 ou SYNB1934 et les données présentées ci-dessus sont les résultats combinés de trois expériences.

Les animaux ont été mis à jeun pendant une nuit la veille de l'administration (jour 1) et tout au long des procédures le jour 1 sans dépasser un maximum de 24 h. Le matin du jour 1, un échantillon de sang de référence a été prélevé sur chaque singe par ponction veineuse. Les animaux ont été temporairement retenus pour l'administration de la dose, mais non sous sédation. Les bactéries lyophilisées ont été remises en suspension et administrées par voie orale à 1011 doses de cellules vivantes à chaque animal, avec 5 ml de bicarbonate de sodium 0,36 M, 7,7 ml de 20 mg/ml de l-phényl-D5-alanine (C/D/N Isotopes Inc.) , et 6,1 ml de digestion peptique peptonée à 500 g/l (Sigma). Le plasma et l'urine cumulée ont été recueillis pour une analyse plus approfondie. Après le dosage, les animaux ont ensuite été remis dans leurs cages et un bac de collecte d'urine propre a été placé au fond de chaque cage. Au total, 6 h après l'administration initiale, le volume cumulé d'urine a été mesuré et enregistré, et les échantillons d'urine ont été conservés à -80 °C. Des échantillons de sang ont été prélevés 0,5, 1, 2, 4 et 6 h après l'administration, et le plasma a été préparé et congelé à -80 °C. Les concentrations de métabolites ont été quantifiées à l'aide d'un test de dérivatisation avec détection LC-MS/MS.

La quantification du TCA, du d5-TCA, de l'HA et du d5-HA a été effectuée à l'aide du mode de surveillance de réactions multiples ciblées (MRM) dans un système Thermo TSQ Quantum Max triple quadripôle Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). Les étalons utilisés étaient l'acide trans-cinnamique (Acros, 158570050), l'acide trans-cinnamique-d5 (CDN Isotopes, D-5284), l'acide hippurique (Sigma, 112003) et l'acide hippurique-d5 (CDN Isotopes, D-5588) .

Les étalons ont été préparés dans de l'eau aux concentrations suivantes : 0,032, 0,16, 0,8, 4, 20, 100 et 250 μg/mL. Les échantillons ont été conservés à –80 °C avant l'analyse. Les échantillons d'urine ont été dilués 40 fois dans de l'eau avant le traitement des échantillons. De la créatinine (Sigma, 60275) a été ajoutée au mélange standard lors de l'analyse de l'HA urinaire et du d5-HA (0,32, 1,6, 8, 40, 200, 1000 et 2500 μg/mL). Dans une plaque à 96 puits, 10 µL des étalons et des échantillons ont été transférés, suivis de l'ajout de 90 µL de solution de dérivatisation (50 mM de 2-hydrazinoquinoléine, de disulfure de dipyridyle et de triphénylphosphine dans de l'acétonitrile avec 1 μg/mL d'isotope marqué interne standard 13C9-15N-Phe (Cambridge Isotopes, CNLM-575-H-PK) et d5-creatinine (CDN Isotopes, D-7707) La plaque a été thermoscellée avec une feuille ThermASeal, mélangée et incubée à 60 °C pendant 1 h pour dérivatiser les échantillons. Les échantillons dérivatisés ont ensuite été centrifugés à 3 200 x g pendant 5 m. Dans une autre plaque, 20 μL des échantillons dérivatisés ont été transférés et encore dilués avec 180 μL d'acide formique à 0,1 % dans de l'eau/acétonitrile ( 140:40). Le volume d'injection utilisé était de 10 µL et la durée d'exécution était de 4,25 m à un débit de 0,5 mL/minute. La phase mobile A était constituée de 0,1 % d'acide formique dans l'eau et la phase mobile B était de 0,1 % d'acide formique. acide dans l'acétonitrile/isopropanol (90:10) La séparation chromatographique a été réalisée à l'aide d'une colonne Phenomenex C18 (3 µm, 100 × 2 mm) avec le gradient suivant : 10 % B de 0 à 0,5 m, 10 à 97 % B de 0,5 à 2 m, 97 % B de 2 à 4 m et 10 % B de 4 à 4,25 m. La surveillance de réactions multiples en mode positif a été utilisée pour l'analyse par spectrométrie de masse en tandem. Les transitions de masse suivantes ont été surveillées pour la quantification : TCA (290/131), d5-TCA (295/136), HA (321/160), d5-HA (326/160) et créatinine (114/44).

Les moyennes de groupe, les erreurs/écarts types et les régressions linéaires ont été calculés dans Microsoft Excel. Pour calculer les valeurs p, des tests t d'étudiants non appariés, une ANOVA unidirectionnelle suivie de tests de comparaison multiple de Tukey ou une ANOVA de Welch avec des tests de comparaison multiple T3 de Dunnett ont été effectués dans Graphpad Prism ou dans Excel. Les aires sous la courbe ont été calculées avec la méthode linéaire-trapézoïdale en utilisant Graphpad Prism et les lignes de base ont été définies par les valeurs moyennes au temps 0 pour chaque expérience applicable.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et les fichiers d'informations supplémentaires qui l'accompagnent). Les données de cytométrie en flux (Fig. 1b) sont fournies sous forme de fichiers .fcs dans le dossier compressé "Fig1b_fcs_files" dans les données source. Toutes les autres données sont fournies dans le fichier "Source data.xlsx". La souche E. coli Nissle 1917 a été obtenue auprès de DSMZ et utilisée pour la construction de souches modifiées conduisant à la génération de SYNB1618 et SYNB1934. Toutes les souches décrites dans ce manuscrit sont issues du même arrière-plan parental. Les souches modifiées décrites dans ce manuscrit peuvent être mises à disposition sous réserve d'un MTA, qui peut être demandé en contactant les auteurs correspondants. La séquence complète du génome de SYNB1618 est disponible sous BioProject ID : PRJNA482064 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA482064). La séquence complète du génome de SYNB1934 est disponible sous BioProject ID : PRJNA749270 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA749270). Les données sources sont fournies avec ce document.

de Groot, MJ, Hoeksma, M., Blau, N., Reijngoud, DJ et van Spronsen, FJ Pathogenèse du dysfonctionnement cognitif dans la phénylcétonurie : examen des hypothèses. taupe. Genet. Métab. 99, S86–S89 (2010).

Article PubMed CAS Google Scholar

Daelman, L., Sedel, F. & Tourbah, A. Manifestations neuropsychiatriques progressives de la phénylcétonurie à l'âge adulte. Rév. Neurol. (Paris). 170, 280-287 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Bilder, DA et al. Revue systématique et méta-analyse des symptômes neuropsychiatriques et du fonctionnement exécutif chez les adultes atteints de phénylcétonurie. Dév. Neuropsychol. 41, 245-260 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Longo, N. et al. Innocuité et efficacité à long terme de la saproptérine : l'expérience du registre PKUDOS. Mol. Genet. Métab. 114, 557–563 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Longo, N. et al. Progression du développement à long terme chez les nourrissons et les jeunes enfants prenant de la saproptérine pour la phénylcétonurie : une analyse de sécurité et d'efficacité sur deux ans. Genet. Méd. 17, 365–373 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Somaraju, UR & Merrin, M. Dichlorhydrate de saproptérine pour la phénylcétonurie. Système de base de données Cochrane. Rév. CD008005 (2010) https://doi.org/10.1002/14651858.CD008005.pub4.

Bell, SM et al. Formulation et optimisation de la PEGylation de la phénylalanine ammoniaque lyase PEGylée thérapeutique pour le traitement de la phénylcétonurie. PLoS One 12, e0173269 (2017).

Article PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Sarkissian, CN et al. Évaluation préclinique de plusieurs espèces de phénylalanine ammoniaque lyase recombinante pégylée pour le traitement de la phénylcétonurie. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 105, 20894–20899 (2008).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Charbonneau, MR, Isabella, VM, Li, N. & Kurtz, CB Développer une nouvelle classe de thérapies bactériennes vivantes conçues pour traiter les maladies humaines. Nat. Commun. 11, 1–11 (2020).

Article CAS Google Scholar

Isabelle, VM et al. Développement d'un agent thérapeutique bactérien vivant synthétique pour la phénylcétonurie, une maladie métabolique humaine. Nat. Biotechnol. 36, 857–864 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Williams, JS, Thomas, M. & Clarke, DJ Le gène stlA code pour une phénylalanine ammonia-lyase impliquée dans la production d'un antibiotique stilbène dans Photorhabdus luminescens TT01. Microbiologie 151, 2543-2550 (2005).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoskins, JA La présence, le métabolisme et la toxicité de l'acide cinnamique et des composés apparentés. J. Appl. Toxicol. 4, 283-292 (1984).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoskins, JA & Gray, J. Phénylalanine ammonia lyase dans la prise en charge de la phénylcétonurie : la relation entre le cinnamate ingéré et l'hippurate urinaire chez l'homme. Rés. Commun. Chim. Pathol. Pharmacol. 35, 275-282 (1982).

CAS PubMed Google Scholar

van Spronsen, FJ et autres Phénylcétonurie. Humide. Tour. Dis. Prim. 7, 1–19 (2021).

Google Scholar

Puurunen, Marja K, et al. Innocuité et pharmacodynamique d'un E. coli Nissle modifié pour le traitement de la phénylcétonurie : une première étude de phase 1/2a chez l'homme. Nat. Métab. 3, 1125-1132 (2021).

Rogers, JK, Taylor, ND & Church, GM Ingénierie des voies biosynthétiques basée sur les biocapteurs. Courant. Avis. Biotechnol. 42, 84-91 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Yang, G. & Withers, SG Criblage FACS à très haut débit pour l'évolution dirigée des enzymes. ChemBioChem 10, 2704–2715 (2009).

Article CAS PubMed Google Scholar

Flachbart, LK, Sokolowsky, S. & Marienhagen, J. Déplacés par des trompeurs : la prévention de la diaphonie des biocapteurs est essentielle pour le succès des campagnes de dépistage à haut débit basées sur les biocapteurs. Synthé ACS. Biol. 8, 1847–1857 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Siedler, S. et al. Développement d'un biocapteur bactérien pour le dépistage rapide de la production d'acide p-coumarique par les levures. Synthé ACS. Biol. 6, 1860–1869 (2017).

Article PubMed CAS Google Scholar

Raman, S., Rogers, JK, Taylor, ND et Church, GM Optimisation guidée par l'évolution des voies de biosynthèse. PNAS 111, 17803–17808 (2014).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Binder, S. et al. Une approche à haut débit pour identifier les variantes génomiques des producteurs de métabolites bactériens au niveau de la cellule unique. Génome Biol. 13, R40 (2012).

Liu, Y. et al. Évolution basée sur les biocapteurs et élucidation d'une voie de biosynthèse chez Escherichia coli. Synthé ACS. Biol. 6, 837–848 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Armetta, J. et al. Approche d'ingénierie enzymatique basée sur les biocapteurs appliquée à la biosynthèse du psicose. Synthé. Biol. 4, 1–10 (2019).

Article CAS Google Scholar

Taylor, ND et al. Concevoir un facteur de transcription allostérique pour répondre à de nouveaux ligands. Nat. Méthodes 13, 177–183 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Snoek, T. et al. Ingénierie guidée par l'évolution des biocapteurs à petites molécules. Nucleic Acids Res. 48, 1–14 (2020).

Article CAS Google Scholar

Machado, LFM, Currin, A. & Dixon, N. Évolution dirigée du facteur de transcription allostérique PcaV pour générer un biocapteur pour les aldéhydes aromatiques. J. Biol. Ing. 13, 1–15 (2019).

Article CAS Google Scholar

MacDonald, MJ & D'Cunha, GB Une vision moderne de la phénylalanine ammoniaque lyase. Biochimie. Cell Biol. 85, 273-282 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wagner, JM et al. Une analyse comparative des FACS à cellule unique et à base de gouttelettes pour améliorer les phénotypes de production : surproduction de riboflavine chez Yarrowia lipolytica. Métab. Ing. 47, 346–356 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Meyer, A. et al. Optimisation d'un biocatalyseur à cellules entières en utilisant des capteurs de produits codés génétiquement à l'intérieur de réacteurs nanolitres. Nat. Chim. 7, 673–678 (2015).

Article CAS PubMed Google Scholar

Weng, L. & Spoonamore, JE Criblage à haut débit activé par la microfluidique des gouttelettes pour l'ingénierie des protéines. Micromachines 10, 734 (2019).

Article PubMed Central Google Scholar

Dunn, MR et al. Systèmes de capteurs. Brevet PCT/US2019/018273 (2019).

Song, Y. et al. Modélisation comparative haute résolution avec RosettaCM. Structure 21, 1735-1742 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Altschul, SF et al. Gapped BLAST et PSI-BLAST : une nouvelle génération de programmes de recherche de bases de données de protéines. Nucleic Acids Res. 25, 3389–3402 (1997).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kamisetty, H., Ovchinnikov, S. & Baker, D. Évaluation de l'utilité des prédictions de contact résidu-résidu basées sur la coévolution dans une ère riche en séquences et en structures. PNAS 110, 15674–15679 (2013).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldwell, J., Moffatt, JR & Smith, RL Survie post-mortem de la formation d'acide hippurique dans des échantillons de tissus de rats et de cadavres humains. Xenobiotica 6, 275–280 (1976).

Article CAS PubMed Google Scholar

Lees, HJ, Swann, JR, Wilson, ID, Nicholson, JK & Holmes, E. Hippurate : l'histoire naturelle d'un cométabolite mammifère-microbien. J. Proteome Res. 12, 1527-1546 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sonnenborn, U. Escherichia coli souche Nissle 1917-du banc au chevet et retour: histoire d'une souche spéciale d'Escherichia coli aux propriétés probiotiques. Microbiol FEMS. Lett. 363, 1–6 (2016).

Article CAS Google Scholar

Schultz, M. Utilisation clinique de E. coli Nissle 1917 dans les maladies inflammatoires de l'intestin. Inflamm. Intestin Dis. 14, 1012-1018 (2008).

Article PubMed Google Scholar

Guo, S. et al. Escherichia coli Nissle 1917 protège la fonction de barrière intestinale en inhibant l'activation médiée par NF-κB de la voie de signalisation MLCK-P-MLC. Médiateurs Inflammation. 2019, 5796491 (2019).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kurtz, C. et al. Développement translationnel de thérapies basées sur le microbiome : cinétique d'E. coli Nissle et souches modifiées chez l'homme et les primates non humains. Clin. Trad. Sci. 11, 200-207 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sato, T., Kiuchi, F. & Sankawa, U. Inhibition de la phénylalanine ammoniaque-lyase par des dérivés d'acide cinnamique et des composés apparentés. Phytochimie 21, 845–850 (1982).

Article CAS Google Scholar

Appert, C., Logemann, E., Hahlbrock, K., Schmid, J. & Amrhein, N. Propriétés structurelles et catalytiques des quatre isoenzymes phénylalanine ammoniaque-lyase du persil (Petroselinum crispum Nym.). EUR. J. Biochem. 225, 491–499 (1994).

Article CAS PubMed Google Scholar

Camm, EL & Towers, GHN Phénylalanine ammoniaque lyase. Phytochimie 12, 961–973 (1973).

Article CAS Google Scholar

Pridham, JB & Woodhead, S. Formes multimoléculaires de phénylalanine-ammoniac lyase dans Alternaria. Biochimie. Soc. Trans. 2, 1070-1072 (1974).

Article CAS Google Scholar

Charbonneau, MR et al. Développement d'un modèle mécaniste pour prédire l'activité biotique synthétique chez des volontaires sains et des patients atteints de phénylcétonurie. Commun. Biol. 4, 1–12 (2021).

Article CAS Google Scholar

Lim, H.-W., Park, S.-S. & Lim, C.-J. Purification et propriétés de la phénylalanine ammonia-lyase de la moutarde en feuilles. Mol. Cellules 7, 715–720 (1997).

CAS PubMed Google Scholar

Sirin, S., Aydas, SB et Aslim, B. Évaluation biochimique de la phénylalanine ammoniaque lyase de la plante endémique Cyathobasis fruticulosa (Bunge) Aellen. pour le traitement diététique de la phénylcétonurie. Technol. Biotechnol. 54, 296–303 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Moffitt, MC et al. Découverte de deux cyanobactéries phénylalanine ammonia lyases : caractérisation cinétique et structurale. Biochimie 46, 1004–1012 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Wilks, JC & Slonczewski, JL pH du cytoplasme et du périplasme d'Escherichia coli : mesure rapide par fluorimétrie de la protéine fluorescente verte. J. Bactériol. 189, 5601–5607 (2007).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt-Dannert, C. & Arnold, FH Évolution dirigée d'enzymes industrielles. Tendances Biotechnol. 17, 135-136 (1999).

Article CAS PubMed Google Scholar

Sawitzke, JA et al. Recombineering : génie génétique in vivo dans E. coli, S. enterica et au-delà. Méthodes Enzymol. 421, 171–199 (2007).

Article CAS PubMed Google Scholar

Remmert, M., Biegert, A., Hauser, A. & Söding, J. HHblits : recherche itérative ultra-rapide de séquences de protéines par alignement HMM-HMM. Nat. Méthodes 9, 173–175 (2012).

Article CAS Google Scholar

Fleishman, SJ et al. RosettaScripts : une interface de langage de script pour la suite de modélisation macromoléculaire Rosetta. PLoS One 6, 26523 (2011).

Park, H. et al. Optimisation simultanée des fonctions énergétiques biomoléculaires sur les caractéristiques des petites molécules et des macromolécules. J. Chem. Calcul théorique. 12, 6201–6212 (2016).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Stemmer, WPC & Morris, SK PCR inverse enzymatique : une méthode de fragment unique indépendante du site de restriction pour une mutagenèse dirigée à haute efficacité. Biotechniques 13, 215-220 (1992).

Google Scholar

Minekus, M. et al. Une méthode normalisée de digestion statique in vitro adaptée à l'alimentation - un consensus international. Fonction alimentaire. 5, 1113-1124 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Henikoff, S. & Henikoff, JG Matrices de substitution d'acides aminés à partir de blocs de protéines. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 89, 10915–10919 (1992).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Talevich, E., Invergo, BM, Cock, PJA & Chapman, BA Bio.Phylo : une boîte à outils unifiée pour le traitement, l'analyse et la visualisation des arbres phylogénétiques dans Biopython. BMC Bioinformatique 13, 209 (2012).

Coq, PJA et al. Biopython : outils Python disponibles gratuitement pour la biologie moléculaire computationnelle et la bioinformatique. Bioinformatique 25, 1422–1423 (2009).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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Les auteurs remercient Caitlin Allen, Mark Charbonneau, Caroline Kurtz et Dave Hava pour leurs commentaires tout au long de ce projet et lors de la préparation de ce manuscrit.

Par Jr. Le voyage

Adresse actuelle : Novo Nordisk Research Center Seattle Inc, 530 Fairview Ave N, Seattle, WA, 98109, États-Unis

Lindong Weng

Adresse actuelle : Sana Biotechnology, 1 Tower Place Suite 500, South San Francisco, CA, 94080, États-Unis

Zymergen Inc. (anciennement enEvolv Inc.), 100 Acorn Park Drive, Cambridge, MA, 02140, États-Unis

Kristin J. Adolfsen, Isolde Callihan, Per Jr. Greisen, James Spoonamore, Lauren E. Fitch, Lindong Weng, Carl J. Weile, Jay H. Konieczka et Adam G. Lawrence

Synlogic Inc, 301 Binney St, Cambridge, MA, 02139, États-Unis

Catherine E. Monahan, Munira Momin, Mary Joan Castillo, Lauren Renaud, Teodelinda Mirabella, Andres Abin-Fuentes et Vincent M. Isabella

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KJA, AGL, VMI et AA ont supervisé le projet. KJA, IC, VMI et AA ont analysé les données. JS a mené la découverte de capteurs. PG a supervisé l'ingénierie des enzymes et fourni toutes les recommandations de conception PAL. Le LEF a conçu par ordinateur les amorces nécessaires pour introduire les mutations, et la bibliothèque combinatoire PAL a été construite par KJA Le dépistage basé sur les capteurs a été effectué par KJA, LW et IC Les essais de biomasse activée sur plaque et le séquençage des variantes ont été effectués par KJA, IC et CWLEF effectué la génération de figures PyMOL. AGL, PG, JS et JHK ont assuré la supervision. CM était responsable de la construction des souches candidates et de la réalisation/analyse des expériences in vitro. AA et MM étaient responsables de la fermentation et de la formulation des souches. MJC a effectué et analysé une analyse par spectroscopie de masse. TM et LR ont supervisé la réalisation des études PSN.

Correspondance à Vincent M. Isabella.

Les auteurs déclarent les intérêts concurrents suivants : tous les auteurs détiennent des actions dans Synlogic, Inc. ou Zymergen, Inc. et peuvent gagner ou perdre financièrement grâce à la publication.

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Réimpressions et autorisations

Adolfsen, KJ, Callihan, I., Monahan, CE et al. Amélioration d'une thérapie bactérienne vivante synthétique pour la phénylcétonurie avec une ingénierie enzymatique activée par biocapteur. Nat Commun 12, 6215 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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Reçu : 14 juin 2021

Accepté : 12 octobre 2021

Publié: 28 octobre 2021

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-021-26524-0

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